人(ren)胃(wei)平(ping)滑(hua)肌細胞(bao)原代培(pei)養指(zhi)南：關(guan)鍵(jian)步驟與成(cheng)功率提升(sheng)策略

　　組織(zhi)取材(cai)與(yu)處理

　　取材(cai)於(yu)胃(wei)組織肌層(ceng)，需(xu)剝離黏膜、外膜及結締(di)組織(zhi)，保(bao)留(liu)中層(ceng)環(huan)形(xing)肌。用含(han)雙(shuang)抗(kang)的(de)PBS清洗(xi)3次(ci)，去(qu)除(chu)血汙(wu)及雜質。若(ruo)懷疑(yi)汙(wu)染，可置於含青鏈(lian)黴(mei)素的(de)混(hun)合液中浸(jin)泡(pao)30~60分鐘。

　　組(zu)織(zhi)塊剪(jian)切與消化(hua)

　　將(jiang)組(zu)織剪成1mm³小塊，采(cai)用兩步(bu)消化(hua)法(fa)：先(xian)加(jia)0.2%膠(jiao)原(yuan)酶-Ⅱ於37℃消化(hua)1小時，待(dai)組(zu)織(zhi)呈(cheng)絮狀後，再(zai)加(jia)0.25%胰蛋白酶消化(hua)15~30分鐘，期(qi)間每隔(ge)10分鐘搖(yao)動(dong)壹次(ci)。消化(hua)後通(tong)過200目濾(lv)網(wang)過濾(lv)，收集濾(lv)液。

　　細胞(bao)接(jie)種(zhong)與(yu)培(pei)養

　　濾(lv)液1000rpm離心(xin)5分鐘，棄(qi)上(shang)清，用含15%FBS的(de)DMEM培(pei)養基(ji)重懸細胞(bao)，按5×10⁵cells/瓶接(jie)種(zhong)至(zhi)T25培(pei)養瓶。置(zhi)於37℃、5%CO₂培(pei)養箱(xiang)中靜置(zhi)培(pei)養，每2~3天換液(ye)壹(yi)次(ci)。

　　二、成功率提升(sheng)策略

　　優(you)化(hua)消化(hua)條件(jian)

　　膠(jiao)原(yuan)酶與胰蛋白酶聯(lian)合使(shi)用可提高(gao)細胞(bao)釋放(fang)效(xiao)率，但(dan)需(xu)嚴(yan)格(ge)控制消化(hua)時間(jian)，避(bi)免(mian)過(guo)度消化(hua)導致細胞(bao)損傷(shang)。建(jian)議通(tong)過顯微鏡觀察(cha)組織(zhi)塊邊緣(yuan)細胞(bao)遊(you)出(chu)情(qing)況，及時終(zhong)止(zhi)消化(hua)。

　　接(jie)種(zhong)密度控制

　　初始(shi)接(jie)種(zhong)密度以5×10⁵cells/瓶為(wei)宜(yi)，密度過低(di)會(hui)導致細胞(bao)間促(cu)生(sheng)長信(xin)號(hao)不足(zu)，密度過高(gao)則引發(fa)營(ying)養(yang)競(jing)爭。傳代時按1:2比(bi)例分瓶，保(bao)證細胞(bao)生(sheng)長空間。

　　培(pei)養環(huan)境管(guan)理(li)

　　使(shi)用預熱的(de)培(pei)養基(ji)，避(bi)免(mian)溫度波動影(ying)響(xiang)細胞(bao)代謝。培(pei)養箱(xiang)需(xu)定(ding)期(qi)校準(zhun)CO₂濃度（5%）及濕度（95%），防止(zhi)細胞(bao)脫(tuo)水(shui)或(huo)酸堿失衡(heng)。

　　汙(wu)染防控(kong)

　　操(cao)作(zuo)全(quan)程(cheng)在超凈工作臺(tai)內(nei)進(jin)行，器(qi)具需高(gao)壓(ya)滅(mie)菌。培(pei)養瓶口(kou)消毒後開(kai)啟(qi)，避(bi)免(mian)直(zhi)接(jie)接(jie)觸瓶口(kou)。若(ruo)發(fa)現(xian)汙(wu)染，立(li)即(ji)棄用並消毒環(huan)境。

　　細胞(bao)純度鑒(jian)定(ding)

　　通(tong)過CD31免(mian)疫(yi)熒(ying)光檢(jian)測(ce)細胞(bao)純度，確保(bao)目(mu)標細胞(bao)占(zhan)比(bi)≥90%。定(ding)期(qi)觀察(cha)細胞(bao)形(xing)態(tai)，排除(chu)成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞(bao)等雜質幹擾(rao)。