常用原代(dai)細(xi)胞培(pei)養(yang)之分(fen)散(san)細(xi)胞培(pei)養(yang)

 

原代(dai)細(xi)胞培(pei)養(yang)中(zhong)zui常用的(de)是分(fen)散細(xi)胞培(pei)養(yang)之壹(yi)。分(fen)散細(xi)胞培(pei)養(yang)，即(ji)將(jiang)組織塊用機械(xie)法(fa)或化學(xue)法(fa)使細(xi)胞分散。如(ru)欲(yu)從(cong)胎(tai)兒或新生兒(er)的(de)組織分離(li)到活(huo)性(xing)的(de)遊(you)離(li)細(xi)胞，經典的(de)方法(fa)是用蛋白(bai)水解酶(mei)（如(ru)胰(yi)蛋白(bai)酶(mei)和膠(jiao)原酶(mei)）消化(hua)細(xi)胞間(jian)的(de)結合(he)物，或用金屬離(li)子(zi)螯合劑（如(ru)EDTA）除去(qu)細(xi)胞互(hu)相(xiang)粘(zhan)著(zhe)所(suo)依(yi)賴的(de)Ca2+，再經機(ji)械輕(qing)度振(zhen)蕩(dang)，使之成(cheng)為(wei)單(dan)細(xi)胞。

 

 

舉(ju)例：神經細(xi)胞分散培(pei)養(yang)實驗(yan)-基(ji)本技(ji)術(shu)指(zhi)南(nan)

從(cong)神經組織解離(li)到建(jian)立(li)原代(dai)細(xi)胞培(pei)養(yang)通常(chang)需要(yao)幾天，甚至(zhi)數(shu)周。這個(ge)過程不僅(jin)繁(fan)瑣， 還很單調(tiao)。其(qi)實還有(you)壹(yi)種(zhong)捷徑(jing)，幾個(ge)小時就(jiu)能(neng)實現從(cong)神經組織到體外(wai)培(pei)養(yang)細(xi)胞系的(de)產(chan)生。 這個(ge)無(wu)縫的(de)流(liu)程讓(rang)研(yan)究(jiu)人(ren)員充分(fen)利用了(le)寶(bao)貴(gui)的(de)樣品(pin)，同時還(hai)有(you)寶(bao)貴(gui)的(de)時間(jian)。本文(wen)就舉(ju)個(ge)例 子，說明(ming)壹(yi)下從(cong)組織樣品(pin)到細(xi)胞培(pei)養(yang)的(de)每(mei)壹(yi)步。

步驟1：神經組織解離(li) 

神經組織的(de)解離(li)是第(di)1步。Neural Tissue Dissociation Kit能(neng)夠(gou)將(jiang)胚(pei)胎、新 生或成(cheng)體來(lai)源的(de)組織溫和解離(li)成(cheng)單細(xi)胞懸液。兩(liang)步的(de)酶(mei)解過程只需(xu)要(yao)不(bu)到壹(yi)個(ge)小時，就(jiu)能(neng) 產(chan)生大(da)量下遊(you)分析即(ji)用的(de)活(huo)細(xi)胞。解離(li)過程可以(yi)手(shou)工完成(cheng)，也(ye)可(ke)自(zi)動完成(cheng)。

解離(li)過 程如(ru)下：

將(jiang)腦(nao)組織切成(cheng)小塊(kuai)，收(shou)集在(zai)HBSS中(zhong)，300×g離(li)心(xin)2分鐘 → 加入(ru)預(yu)熱(re)的(de)酶(mei)混 合(he)物1，37°C孵(fu)育 → 再加入(ru)酶(mei)混合(he)物2 → 解離(li)（手(shou)工解離(li)或自(zi)動解離(li)）→ 加(jia)到30 μm 細(xi)胞濾器中(zhong)，用HBSS洗(xi)滌(di)兩(liang)次

 

步驟2：髓磷(lin)脂(zhi)碎(sui)片的(de)去(qu)除+神經細(xi)胞的(de)分離(li)

獲(huo)得了(le)單(dan)細(xi)胞 懸液之後(hou)，下壹(yi)步就是目(mu)的(de)細(xi)胞的(de)分離(li)。在(zai)細(xi)胞分離(li)方(fang)面，MACS技(ji)術(shu)無(wu)疑是金(jin)標準(zhun)，目(mu) 前(qian)發(fa)表(biao)的(de)文(wen)獻已達(da)12000多篇。別急，在(zai)細(xi)胞分離(li)之前(qian)還有(you)壹(yi)個(ge)小插(cha)曲。那就是去(qu)除對(dui)後(hou) 續免(mian)疫標記(ji)有(you)幹擾的(de)髓磷(lin)脂(zhi)（myelin）。美天旎zui近(jin)推(tui)出(chu)的(de)Myelin Removal Beads能(neng)夠(gou)從(cong) 神經細(xi)胞懸液中(zhong)去(qu)除髓磷(lin)脂(zhi)，標記(ji)+分(fen)離(li)的(de)全過程只需(xu)要(yao)35分(fen)鐘。

髓磷(lin)脂(zhi)的(de)去(qu)除是了(le)為(wei)回(hui)收(shou)率。做過比對(dui)實驗(yan)，將(jiang)步驟1得到的(de)細(xi)胞懸液分(fen)成(cheng)兩(liang)組，壹(yi)組用 Myelin Removal Beads處(chu)理，壹(yi)組不處(chu)理。然(ran)後(hou)分別從(cong)兩(liang)組中(zhong)分離(li)神經前(qian)體細(xi)胞。*組 （處(chu)理過）的(de)回收(shou)率達(da)95%，第(di)二(er)組（未處(chu)理）只(zhi)有80%。

 

步驟3：神經細(xi)胞培(pei)養(yang)     分離(li)到了(le)妳(ni)想(xiang)要(yao)的(de)神經細(xi)胞， 下壹(yi)步就是原代(dai)細(xi)胞培(pei)養(yang)了(le)。