HL-60細(xi)胞(bao)之細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)技(ji)術(shu)指(zhi)南

HL-60細胞(bao)介紹

HL-60細(xi)胞(bao)株http://www.atcccell.com/ATCCcell-Products-14206745/即(ji)人前髓(sui)細胞(bao)為白(bai)血病株（早(zao)幼(you)粒(li)細胞(bao)）。該細胞(bao)經(jing)過不(bu)同(tong)的(de)處理可(ke)誘導(dao)分化為嗜中(zhong)性或(huo)嗜酸性細(xi)胞(bao)，具有(you)血細胞(bao)的壹些特征。

HL-60細(xi)胞(bao)之細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)技(ji)術(shu)指(zhi)南如(ru)下(xia)：

在(zai)培(pei)養(yang)基中補充(chong)牛胎(tai)兒(er)血清(qing).HEPES，抗(kang)生(sheng)素(su)類(lei)化(hua)學物質，L-谷(gu)氨酰胺(an)，通(tong)過懸浮培(pei)養(yang)，hl-60細(xi)胞(bao)能持(chi)續增(zeng)值(zhi)。加(jia)倍(bei)時間(jian)大(da)約(yue)是(shi)36-48小(xiao)時。這個細胞(bao)株是(shi)在(zai)National Cancer Institute[1]（美(mei)國國家癌癥研究(jiu)所）從(cong)壹個36歲患急性早(zao)幼(you)粒(li)細胞(bao)白血病的男(nan)人身上得到的。

HL60細(xi)胞(bao)增值(zhi)需要(yao)transferrin（轉(zhuan)鐵蛋白(bai)）和(he)胰島素(su)受(shou)體(ti)，細(xi)胞(bao)表面表達(da)有(you)這兩(liang)種(zhong)物(wu)質。這兩(liang)種(zhong)物(wu)質是(shi)必須的，壹旦這兩(liang)種(zhong)復(fu)合物(wu)任(ren)意壹種(zhong)從(cong)無血清(qing)培(pei)養(yang)基中除去(qu)，那麽(me)hl-60細胞(bao)立(li)即(ji)停(ting)止(zhi)增(zeng)值。成熟的粒(li)細胞(bao)自發(fa)分化可(ke)以用 dimethyl sulfoxide （DMSO）（二甲(jia)亞(ya)碸(feng)）retinoic acid（維甲(jia)酸(suan)）等化(hua)學物質誘(you)導(dao)。其(qi)他(ta)諸(zhu)如(ru) 1,25-dihydroxyvitamin D3（二(er)羥(qiang)維生素(su)D）. 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate （TPA）（對二苯甲(jia)酸(suan)），GM-CSF等化(hua)學物質能(neng)夠(gou)分別誘導hl-60細(xi)胞(bao)分化出單核細(xi)胞(bao)，巨噬細胞(bao)，嗜酸(suan)性粒(li)細胞(bao)的表型。

懸(xuan)浮白血病細胞(bao)HL-60的培(pei)養(yang)上清(qing)液對HUVECs的血管形(xing)成能(neng)力(li)的(de)影響
1 材料(liao)與方法(fa)
1.1 材料(liao)及試劑
1.1.1 細胞(bao)培(pei)養(yang)材料(liao)： RPMI1640培(pei)養(yang)基，小牛血清(qing)，人急性白(bai)血病細胞(bao)株（Hl-60），人(ren)臍靜(jing)脈內皮細(xi)胞(bao)（HUVECs）。
1.1.2 主(zhu)要(yao)藥品(pin)與試(shi)劑(ji)：二(er)甲(jia)亞(ya)碸(feng)（DMSO）；MTT，Amresco公司產(chan)品(pin)；0.25%胰酶；HEPE；逆(ni)轉錄及PCR試劑盒；瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝膠，美(mei)國Sigma公司產品(pin)。
2 實驗(yan)方法(fa)
2.1 細胞(bao)培(pei)養(yang)： HL-60懸(xuan)浮細胞(bao)、HUVECs在(zai)含(han)10%小牛血清(qing)的1640培(pei)養(yang)液(ye)中於5%CO2恒(heng)溫(wen)培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)常規培(pei)養(yang)。K562細(xi)胞(bao)每1-2天換液(ye)傳(chuan)代壹次，HUVECs每2-3天換液(ye)傳(chuan)代壹次。
2.2 MTT比色(se)實驗(yan)檢(jian)測細胞(bao)增殖情況：取對數生長期HUVECs調(tiao)整細(xi)胞(bao)濃度(du)為1×105/ml，接(jie)種(zhong)於(yu)96孔(kong)培(pei)養(yang)板(ban)，每(mei)孔(kong)100μL，每板(ban)種(zhong)2組(zu)，每組十個復(fu)孔(kong)，共種(zhong)3板(ban)。待(dai)4小時鏡下觀察(cha)細(xi)胞(bao)貼壁後(hou)，*組每(mei)孔(kong)加(jia)培(pei)養(yang)12h的(de)HL-60細胞(bao)上清(qing)100μL，第(di)二組(zu)每孔(kong)加(jia)1640培(pei)養(yang)基100μL，分別培(pei)養(yang)24、48、72h後(hou)，每孔(kong)加(jia)入(ru)MTT（5mg/ml）20μL，繼續培(pei)養(yang)4h，吸去(qu)上清(qing)液，每(mei)孔(kong)加(jia)DMSO180μL，在(zai)酶聯(lian)免疫檢(jian)測儀上以570nm為(wei)檢(jian)測波長，讀(du)取吸光度（A）值(zhi)。
2.3 RT-PCR技(ji)術(shu)檢(jian)測HUVECs CyclinE及VEGF mRNA表達(da)：a.對照組: 將(jiang)HUVECs濃(nong)度調(tiao)整為(wei)1×105/ml的(de)細胞(bao)懸液(ye),接(jie)種(zhong)5ml於(yu)細胞(bao)培(pei)養(yang)瓶(ping)中，4小時鏡下觀察(cha)其(qi)貼壁後(hou)加(jia)入(ru)5ml培(pei)養(yang)基。 b.實驗(yan)組: 將(jiang)HUVECs濃(nong)度(du)調(tiao)整為(wei)1×105/ml細(xi)胞(bao)懸液(ye),接(jie)種(zhong)5ml於(yu)細胞(bao)培(pei)養(yang)瓶(ping)中，4小時鏡下觀察(cha)其(qi)貼壁後(hou)加(jia)入(ru)培(pei)養(yang)12h的(de)K562細胞(bao)上清(qing)液5ml。兩(liang)組細胞(bao)培(pei)養(yang)72h後(hou)，棄(qi)去(qu)培(pei)養(yang)瓶(ping)中培(pei)養(yang)液(ye)，PBS輕柔清(qing)洗(xi)細胞(bao)2-3次，Trizol法(fa)提取兩(liang)組HUVECs總(zong)mRNA，按照逆(ni)轉錄試劑(ji)盒說(shuo)明(ming)書(shu)進行(xing)逆(ni)轉錄。以逆(ni)轉錄反應(ying)產物為(wei)模(mo)板(ban)按，按照PCR試劑(ji)盒(he)說明書(shu)進行(xing)PCR擴增(zeng)。根據文(wen)獻報道[3]擴(kuo)增(zeng)CyclinEmRNA及VEGFmRNA的引物序(xu)列(lie)，並用Oligo引物(wu)設計軟(ruan)件(jian)檢(jian)測。CyclinEmRNA上遊(you)引(yin)物(wu)：5-CTGGATGTTGACTGCCTTGA-3，下遊(you)引(yin)物(wu)：5-CCGCTGCTCTGCTTCTTAC-3。VEGFmRNA上遊(you)引(yin)物(wu)：5-CAAATCCACCCACTATGA-3，下遊(you)引(yin)物(wu)：5-CCGCCTCGGCTTGTC-3.β-action上遊(you)引(yin)物(wu)：5-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3 ，下遊(you)引(yin)物(wu)：5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。反應(ying)參數為(wei)：95℃預(yu)變(bian)性5min,95℃變(bian)性40s,53℃退(tui)火35s,72℃延(yan)伸(shen)35s，共30個循環，zui後(hou)於72℃保(bao)溫10min終(zhong)止(zhi)反應(ying)。然(ran)後(hou)取反應(ying)產物進行(xing)瓊脂(zhi)糖(tang)凝膠電泳。
2.4 統(tong)計(ji)學處(chu)理：實驗(yan)結(jie)果(guo)采用SPSS13.0統計(ji)學(xue)軟件進行(xing)統計(ji)學分析，數(shu)據用平均數(shu)±標準(zhun)誤(wu)表示（means±S.E.）。多組均(jun)數間(jian)的(de)比(bi)較采用F檢(jian)驗(yan)。以P＜0.05或(huo)P＜0.01判(pan)斷差(cha)異(yi)有(you)統(tong)計學意(yi)義(yi)。 3 結(jie)果(guo)
3.1 K562細(xi)胞(bao)上清(qing)對HUVECs促(cu)增殖作用
噻唑藍(lan)（MTT）還原法(fa)檢(jian)測兩(liang)組培(pei)養(yang)24、48、72小(xiao)時後(hou)HUVECs增殖速(su)度(du)（圖1）。結(jie)果(guo)顯(xian)示實驗(yan)組中(zhong)HUVECs較對照組HUVECs增(zeng)殖明顯(xian)加(jia)快，並呈時間(jian)依賴性， 72小(xiao)時後(hou)差異(yi)具有(you)顯(xian)著性意(yi)義（P<0.05）。



圖(tu)1 兩(liang)組培(pei)養(yang)24h、48h、72hHUVECs吸光值比(bi)較（n=10 *P<0.05） 3.2 實驗(yan)組HUVECs較對照組HUVECs CyclinEmRNA表達(da)明顯增(zeng)高
實驗(yan)組、對照組培(pei)養(yang)72h後(hou)，RT-PCR檢(jian)測顯示：實驗(yan)組HUVECs較對照組HUVECs CyclinEmRNA表達(da)明顯增(zeng)加(jia)。灰(hui)度掃(sao)描顯(xian)示實驗(yan)組較對照組HUVECs CyclinEmRNA表達(da)差異有(you)顯(xian)著性意(yi)義（P<0.01）（圖2）。



圖(tu)2 RT-PCR檢(jian)測組兩(liang)HUVECs CyclinEmRNA表達(da)水平 （**p<0.01）
3.3 實驗(yan)組HUVECs較對照組HUVECs VEGFmRNA表達(da)明顯增(zeng)高
實驗(yan)組、對照組培(pei)養(yang)72h後(hou)，RT-PCR檢(jian)測顯示：實驗(yan)組HUVECs較對照組HUVECs VEGFmRNA表達(da)明顯增(zeng)加(jia)。灰(hui)度掃(sao)描顯(xian)示實驗(yan)組HUVECs較對照組HUVECs VEGFmRNA表達(da)差異有(you)顯(xian)著性意(yi)義（P<0.01）（圖3）。




（（來源：乾(qian)思(si)生(sheng)物(wu)細胞(bao)培(pei)養(yang)網(wang)  http://www.atcccell.com/   ）