基(ji)因組DNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)簡(jian)介(jie)

DNA是遺(yi)傳(chuan)信(xin)息(xi)的載體，是(shi)zui重要(yao)的(de)生物信息分(fen)子，是(shi)分子生(sheng)物學(xue)研究的主要(yao)對(dui)象(xiang)，為了進行(xing)測(ce)序(xu)、雜交(jiao)、基(ji)因表達、文(wen)庫(ku)構(gou)建(jian)等(deng)試驗(yan)，獲(huo)得(de)高(gao)分子量(liang)和(he)高(gao)純(chun)度的基(ji)因組DNA是(shi)非常(chang)重要(yao)的(de)前提，因此基(ji)因組DNA的(de)提取(qu)也是分(fen)子生(sheng)物學(xue)試驗(yan)技(ji)術(shu)中(zhong)zui重要(yao)、zui基(ji)本的(de)操作之(zhi)壹(yi)。 Solarbio公(gong)司提供各(ge)種(zhong)不同(tong)樣品(pin)基(ji)因組DNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)，如(ru)植物(wu)、動(dong)物(wu)、細(xi)菌(jun)、細(xi)胞(bao)、血(xue)液、酵(jiao)母(mu)等(deng)基(ji)因組DNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)。所(suo)提取(qu)的基(ji)因組純(chun)度高，片段(duan)大(da)小(xiao)在50kb左(zuo)右(you)。用戶可根據需(xu)要(yao)選(xuan)用不同(tong)的試(shi)劑(ji)盒(he)來(lai)進(jin)行(xing)不同(tong)樣品(pin)的(de)抽提(ti)。   

壹(yi)、基(ji)因組DNA提(ti)取(qu)的原則(ze) 

1、保(bao)證(zheng)核(he)酸壹(yi)級結構(gou)的(de)完(wan)整性（因為遺(yi)傳(chuan)信(xin)息(xi)全部儲存(cun)在(zai)核酸壹(yi)級結構(gou)中(zhong)，故完(wan)整的(de)壹(yi)級結構(gou)是(shi)保(bao)證(zheng)核(he)酸結構(gou)與功(gong)能研究的基(ji)層）。   

2、排除(chu)其它(ta)分(fen)子（如(ru)蛋(dan)白質、多(duo)糖(tang),、脂類(lei)、有機(ji)溶劑(ji)等(deng)）的汙染(ran)，使下(xia)遊(you)試(shi)驗順(shun)利進行。   

二、基(ji)因組DNA提(ti)取(qu)的原理(li)和(he)方法(fa) 

DNA與組蛋(dan)白構(gou)成核小(xiao)體，核(he)小(xiao)體纏(chan)繞(rao)成中空(kong)的(de)螺(luo)旋(xuan)管(guan)狀(zhuang)結(jie)構(gou)，即(ji)染(ran)色(se)絲，染(ran)色(se)絲再(zai)與許(xu)多(duo)非組蛋(dan)白形成染(ran)色(se)體。染(ran)色(se)體存(cun)在(zai)於細(xi)胞(bao)核(he)中，外(wai)有(you)核膜(mo)及(ji)胞(bao)膜(mo)。從組織(zhi)中提取(qu)DNA必須(xu)先(xian)將組織(zhi)分散(san)成單個(ge)細(xi)胞(bao)，然(ran)後(hou)破(po)碎胞(bao)膜(mo)及(ji)核(he)膜(mo)，使染(ran)色(se)體釋(shi)放(fang)出(chu)來，同(tong)時(shi)去(qu)除與DNA結(jie)合的組蛋(dan)白及(ji)非(fei)組蛋(dan)白。  

 1、樣品預處(chu)理(li)  從各種(zhong)不同(tong)來源的樣品（如(ru)細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母(mu)、血(xue)液、動(dong)植物(wu)組織(zhi)細(xi)胞(bao)等(deng)）中提(ti)取(qu)高純度的基(ji)因組DNA，因(yin)細(xi)胞(bao)結(jie)構(gou)及(ji)所(suo)成分不同(tong)，樣品(pin)預處(chu)理(li)方式也(ye)不同(tong)，以(yi)下(xia)簡(jian)單(dan)介(jie)紹(shao)常(chang)用提取(qu)材料(liao)的預處(chu)理(li)方式，若(ruo)需(xu)詳(xiang)細(xi)了(le)解(jie)，請參考本公(gong)司各基(ji)因組DNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)。    部分樣(yang)品(pin)預處(chu)理(li)方式 植物(wu)材(cai)料(liao)液氮研(yan)磨(mo) 動(dong)物(wu)材料(liao)勻漿(jiang)、液氮研(yan)磨(mo) 培(pei)養細(xi)胞(bao)蛋(dan)白酶K處理(li) 細(xi)菌(jun)溶菌(jun)酶(mei)破(po)壁(bi)  酵母(mu)破(po)壁(bi)酶破(po)壁(bi)、玻璃(li)珠研磨(mo) 血(xue)液紅(hong)細(xi)胞(bao)裂解液去(qu)紅細(xi)胞(bao)    

  2、細(xi)胞(bao)裂解 CTAB法(fa)：適用於植物(wu)組織(zhi)、真菌(jun)等(deng)。 

CTAB是壹(yi)種(zhong)陽(yang)離子去(qu)汙劑(ji)，可溶解細(xi)胞(bao)膜(mo)，並與核(he)酸形成復合(he)物。該復合物在高鹽(yan)溶液中(zhong)（>0.7M NaCl）是(shi)可溶的，通過有機(ji)溶劑(ji)抽提(ti)，去(qu)除蛋(dan)白、多(duo)糖(tang)、多(duo)酚等(deng)雜質後(hou)加入(ru)乙(yi)醇(chun)沈(chen)澱(dian)即可使核酸分離出(chu)來。   SDS法(fa)： 

適(shi)用於細(xi)菌(jun)、血(xue)液、酵(jiao)母(mu)、動(dong)物(wu)組織(zhi)、細(xi)胞(bao)等(deng)。 

SDS是壹(yi)種(zhong)陰(yin)離子去(qu)汙劑(ji)，可溶解細(xi)胞(bao)膜(mo)，裂解細(xi)胞(bao)，使蛋(dan)白質變(bian)性、染(ran)色(se)體解(jie)析(xi)。   

其它(ta)裂解方法(fa)： 

物理(li)方式：機(ji)械剪切(qie)、超(chao)聲波破(po)碎、研(yan)磨(mo)勻(yun)漿(jiang)等(deng)

化學方式：異(yi)硫(liu)氰酸胍、堿裂解等(deng)

酶法(fa)：蛋(dan)白酶K   

3、DNA分離純化 純化要(yao)求： 

核(he)酸樣品中不應(ying)存(cun)在對酶(mei)（如(ru)核(he)酸內切(qie)酶(mei)、DNA聚合(he)酶(mei)等(deng)）有抑(yi)制作用的成分。 

其它(ta)生(sheng)物大(da)分子如(ru)蛋(dan)白質、多(duo)糖(tang)、多(duo)酚和(he)脂(zhi)類(lei)分子等(deng)汙染(ran)應(ying)降(jiang)低(di)到zui低(di)程(cheng)度。 

排除(chu)其它(ta)核(he)酸分子的(de)汙染(ran)，如(ru)提(ti)DNA時(shi)應(ying)去(qu)除RNA，反之(zhi)亦(yi)然。 

純化方法(fa)： 

細(xi)胞(bao)破(po)碎後(hou)，常使用吸附材(cai)料(liao)結合(he)方法(fa)去(qu)除雜質和(he)純(chun)化DNA，主要(yao)有(you)矽基(ji)質材料(liao)、陰離(li)子交(jiao)換(huan)樹脂和(he)磁珠等(deng)。因矽(gui)基(ji)質材料(liao)可特異吸附核(he)酸DNA，使用方便、快捷，不需要(yao)使用有毒溶劑(ji)如(ru)酚(fen)、氯仿等(deng)，使得(de)提(ti)取(qu)基(ji)因組像過濾壹(yi)樣簡(jian)單(dan)，因(yin)此矽(gui)基(ji)質材料(liao)成為大規模(mo)分(fen)離(li)純化DNA的通用方法(fa)。   

矽基(ji)質材料(liao)吸附核(he)酸的原理(li)：主(zhu)要(yao)利用DNA在高(gao)鹽低(di)pH值環(huan)境(jing)下(xia)與矽(gui)基(ji)質材料(liao)相(xiang)結(jie)合(he)，在低(di)鹽(yan)高(gao)pH值環(huan)境(jing)下(xia)與矽(gui)基(ji)質材料(liao)脫(tuo)離的(de)特征(zheng)。其機(ji)理(li)可能是高(gao)濃度鹽離(li)子破(po)壞(huai)了矽(gui)基(ji)質水分(fen)子結(jie)構(gou)，形成陽離(li)子橋(qiao)，當(dang)鹽(yan)被清除後(hou)，再(zai)水化的矽(gui)石(shi)破(po)壞(huai)了基(ji)質和(he)DNA之(zhi)間的吸引(yin)力，因而(er)DNA從矽基(ji)質上(shang)被洗脫(tuo)下(xia)來。   

註意事項(xiang)： 

盡(jin)量(liang)簡(jian)化操作步(bu)驟，縮短提(ti)取(qu)過程(cheng)，以(yi)減(jian)少各(ge)種(zhong)有(you)害因素(su)對核(he)酸的破(po)壞(huai)。   

減(jian)少化學物(wu)質對DNA的(de)降(jiang)解(jie)，為避免(mian)過(guo)酸、過堿對DNA雙鏈中(zhong)磷(lin)酸二酯鍵(jian)的破(po)壞(huai)，操作多(duo)在pH值4.0-10.0的條(tiao)件下(xia)進行(xing)。   

防(fang)止(zhi)基(ji)因組DNA的(de)生物(wu)降(jiang)解(jie)，主要(yao)是(shi)DNase降(jiang)解(jie)基(ji)因組DNA，DNase需(xu)二價金屬陽離子如(ru)Mg2+等(deng)的激(ji)活(huo)，可用EDTA等(deng)金屬離子螯和(he)劑(ji)螯和(he)Mg2+以(yi)抑制DNase的活(huo)性。   

減(jian)少物(wu)理(li)因(yin)素(su)對DNA的(de)降(jiang)解(jie)，物理(li)降(jiang)解(jie)因素(su)主要(yao)包括(kuo)機(ji)械剪切(qie)力（如(ru)劇(ju)烈(lie)振(zhen)蕩(dang)、攪(jiao)拌等(deng)），細(xi)胞(bao)突然(ran)置於低(di)滲(shen)液中(zhong)導(dao)致(zhi)的(de)細(xi)胞(bao)爆(bao)炸式破(po)裂，DNase大量(liang)釋放(fang)，樣品(pin)反復(fu)凍(dong)融和(he)高(gao)溫(wen)等(deng)。   

4、DNA洗脫(tuo)收(shou)集 

DNA的(de)洗脫(tuo)效(xiao)率取(qu)決於以(yi)下(xia)重要(yao)因(yin)素(su)：

洗脫(tuo)液成分： 

采(cai)用矽基(ji)質膜(mo)吸附的(de)DNA，可將DNA在(zai)低(di)鹽(yan)高(gao)pH值條件下(xia)洗脫(tuo)下(xia)來。pH值在7.0-8.5之(zhi)間洗脫(tuo)效(xiao)率較高(gao)，pH值低(di)於7.0則(ze)洗脫(tuo)效(xiao)率很低(di)。壹(yi)般基(ji)因組提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)中(zhong)的(de)洗脫(tuo)緩(huan)沖液就(jiu)是(shi)TE（pH8.0），既為DNA從矽基(ji)質膜(mo)上(shang)洗脫(tuo)下(xia)來提(ti)供良(liang)好(hao)的pH環(huan)境(jing)，其中(zhong)的(de)EDTA又(you)能保(bao)證(zheng)DNA不被DNase降(jiang)解(jie)，同(tong)時(shi)由於EDTA濃度非常(chang)低(di)，對(dui)核(he)酸內切(qie)酶(mei)、DNA聚合(he)酶(mei)的(de)影(ying)響(xiang)非(fei)常(chang)微(wei)弱(ruo)，不影(ying)響(xiang)後(hou)續試(shi)驗，可放心(xin)使用。   

洗脫(tuo)液體積(ji)： 

當(dang)洗脫(tuo)液體積(ji)小(xiao)於30ul時(shi)，洗脫(tuo)效(xiao)率很低(di)且(qie)不穩(wen)定；當(dang)洗脫(tuo)液體積(ji)在(zai)50-200ul時(shi)，洗脫(tuo)效(xiao)率穩(wen)定在(zai)80-90﹪，並可保(bao)證(zheng)得(de)到zui大(da)產量(liang)，因此洗脫(tuo)液體積(ji)不能小(xiao)於30ul。   

加洗脫(tuo)液部位： 

100-200ul洗脫(tuo)液能(neng)*覆(fu)蓋(gai)矽(gui)基(ji)質膜(mo)，DNA的(de)洗脫(tuo)量(liang)可得(de)到保(bao)證(zheng)，但(dan)當(dang)洗脫(tuo)液體積(ji)較少如(ru)30-50ul時(shi)，須在(zai)矽(gui)基(ji)質膜(mo)中(zhong)間部分懸(xuan)空(kong)滴(di)加洗脫(tuo)液，以(yi)確(que)保(bao)少量(liang)的洗脫(tuo)液能(neng)*覆(fu)蓋(gai)矽(gui)膠(jiao)膜(mo)。   

洗脫(tuo)液的(de)溫(wen)度：                                                           在加(jia)洗脫(tuo)液之(zhi)前(qian)，先(xian)將洗脫(tuo)液在(zai)60-75℃水(shui)浴中(zhong)預熱10分(fen)鐘，可有效(xiao)提高(gao)DNA的洗脫(tuo)效(xiao)率。   

洗脫(tuo)時(shi)間和(he)次(ci)數(shu)： 

加入(ru)預熱的(de)洗脫(tuo)液後(hou)，可在室溫(wen)放(fang)置2-5分鐘使DNA*溶解在(zai)洗脫(tuo)液裏(li)通過離心(xin)而洗脫(tuo)下(xia)來。同(tong)時(shi)可進行二次或三次(ci)洗脫(tuo)，即將前(qian)次洗脫(tuo)下(xia)來的(de)洗脫(tuo)液再(zai)上(shang)柱、離心(xin)，使前次(ci)沒有洗脫(tuo)下(xia)來的(de)DNA再(zai)次溶解在(zai)洗脫(tuo)液裏(li)，從而提(ti)高DNA的產量(liang)。   

5、DNA的定量(liang)及(ji)檢(jian)測(ce) 

提取(qu)得(de)到的(de)DNA段(duan)需從分子質量(liang)、濃度、純度等(deng)方面進行檢測(ce)，從而判(pan)斷DNA質量(liang)。 

用瓊脂糖(tang)凝膠(jiao)電泳(yong)分析(xi)DNA分(fen)子質量(liang)： 

得(de)到的(de)基(ji)因組DNA段(duan)的大(da)小(xiao)與樣(yang)品保(bao)存(cun)時(shi)間、操作過(guo)程(cheng)中的(de)剪切(qie)力等(deng)因素(su)有關。Solarbio公(gong)司的基(ji)因組DNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)提(ti)取(qu)的不同(tong)材料(liao)基(ji)因組DNA段(duan)大小(xiao)壹(yi)般在50kb左右(you)，能很好(hao)地(di)滿足(zu)後(hou)續試(shi)驗的(de)要(yao)求。   

通常用瓊脂糖(tang)凝膠(jiao)電泳(yong)分析(xi)DNA分(fen)子質量(liang)時(shi)，以(yi)溴酚藍(lan)為示(shi)蹤(zong)染(ran)料(liao)，EB染(ran)色(se)，紫外(wai)觀察(cha)，並與DNA分(fen)子量(liang)標準對(dui)照(zhao)即(ji)可判(pan)斷所(suo)提DNA的平(ping)均分子量(liang)。高質量(liang)的基(ji)因組DNA應(ying)顯(xian)示(shi)為單壹(yi)條帶，如(ru)DNA降(jiang)解(jie)則(ze)表現(xian)為彌(mi)散(san)條帶。   

用紫外(wai)分光光度計檢(jian)測(ce)DNA濃度和(he)純(chun)度：

濃度測定： 

DNA在(zai)OD260處(chu)有(you)顯(xian)著(zhu)吸收(shou)峰，OD260值為1相(xiang)當(dang)於大約50ug/ml雙鏈DNA。 

以(yi)下(xia)簡(jian)單(dan)介(jie)紹(shao)OD260的(de)測(ce)定方法(fa)： 所(suo)提基(ji)因組DNA樣(yang)品=100ul 

進(jin)行OD260值測定的(de)待(dai)測(ce)樣(yang)品=20ul所(suo)提基(ji)因組DNA樣(yang)品+180ul TE=200ul 

DNA稀(xi)釋倍數(shu)=200ul/20ul=10倍 如(ru)200ul待(dai)測樣品(pin)OD260值=0.2 

待測(ce)樣品(pin)濃度（即100ul基(ji)因組DNA樣(yang)品濃度）=50ug/ml×OD260值×稀釋(shi)倍數(shu)=100 ug/ml 

所(suo)提100ul基(ji)因組DNA樣(yang)品總(zong)量(liang)=100 ug/ml×100ul=10ug DNA 純度測定： 

壹(yi)般用OD260/OD280值檢測(ce)DNA樣品(pin)的(de)純(chun)度。正(zheng)常(chang)OD260/OD280值約為1.7-1.9，說明DNA純(chun)度較好(hao)；若OD260/OD280值小(xiao)於1.7，說明可能有蛋(dan)白汙染(ran)；若(ruo)OD260/OD280值大於2.0，說明可能有RNA汙染(ran)或DNA已經降(jiang)解(jie)。 

註：因為pH值和(he)離(li)子會影(ying)響(xiang)光吸收(shou)值，因此洗脫(tuo)時(shi)如(ru)不使用洗脫(tuo)緩(huan)沖液，而(er)使用去(qu)離子水(shui)，OD260/OD280值會偏低(di)，但(dan)並不表示(shi)純(chun)度低(di)。   

6、DNA的(de)儲(chu)存(cun) 儲(chu)存溶液： 

DNA為兩性解離分子，在(zai)堿性條件下(xia)較穩(wen)定，因(yin)此壹(yi)般用TE（pH8.0）保(bao)存(cun)。TE的(de)成分為：10 mM Tris-HCl（Tris與鹽(yan)酸形成強的(de)緩(huan)沖對）；1 mM EDTA（乙(yi)二胺四乙(yi)酸，能螯合二價金屬陽離子，抑(yi)制DNase的活(huo)性）；pH8.0（堿性條件可減(jian)少DNA的(de)脫(tuo)氨(an)作用，防(fang)止(zhi)降(jiang)解(jie)）。ddH2O的正(zheng)常(chang)pH值為7.0，可作為DNA的儲存(cun)液，但(dan)有(you)些(xie)試(shi)驗室制備的(de)ddH2O呈(cheng)酸性（pH值小(xiao)於7.0），這不僅影(ying)響(xiang)DNA的(de)洗脫(tuo)效(xiao)率，而且(qie)導致(zhi)長(chang)時(shi)間保(bao)存(cun)的(de)DNA容(rong)易(yi)發生降(jiang)解(jie)。因此建(jian)議(yi)用TE作為DNA的長(chang)期儲存(cun)液。

儲(chu)存(cun)條件： 

為避免(mian)DNA降(jiang)解(jie)，提取(qu)的DNA應(ying)**行(xing)分裝，然(ran)後(hou)置於-20℃或-70℃保(bao)存(cun)，同(tong)時(shi)註意避免(mian)反復(fu)凍(dong)融造成DNA降(jiang)解(jie)。