流(liu)式(shi)細(xi)胞術常(chang)見(jian)問題(ti)及其(qi)解(jie)答

BioLegend公(gong)司(si)提(ti)供(gong)了(le)哪些熒(ying)光標記(ji)抗(kang)體(ti)？

答：BioLegend公(gong)司(si)提(ti)供(gong)APC、APC/Cy7、Alexa FluorTM 488、Alexa FluorTM 647、Alexa FluorTM 700、Biotin、Brilliant VioletTM 421、FITC、DyLightTM 594、DyLightTM 649、Pacific BlueTM、PE、PE/Cy5、PE/Cy7、PerCP、PerCP/Cy5.5共(gong)計(ji)16種熒(ying)光素標記(ji)的(de)7000多(duo)種流(liu)式(shi)抗(kang)體(ti)供(gong)客戶選(xuan)擇。

流(liu)式(shi)細(xi)胞實(shi)驗的對照(zhao)應(ying)該如(ru)何(he)設(she)置？什(shen)麽是(shi)同型對照(zhao)？

答：①在(zai)應(ying)用流(liu)式(shi)技(ji)術檢測(ce)細(xi)胞表(biao)面(mian)抗(kang)原時(shi)，我們通常(chang)要(yao)設(she)的壹(yi)個對照(zhao)就(jiu)是(shi)同型對照(zhao)。

同型(xing)對照(zhao)：使用與熒(ying)光標記(ji)抗(kang)體(ti)相同(tong)來源(yuan)、相(xiang)同(tong)標記(ji)、相(xiang)同(tong)劑量和(he)亞型的(de)免(mian)疫球(qiu)蛋白，用於(yu)消(xiao)除(chu)由(you)於(yu)抗體非特(te)異(yi)性結合到(dao)細(xi)胞表(biao)面(mian)而(er)產(chan)生(sheng)的(de)背景(jing)染色(se)。

②細(xi)胞因(yin)子的流(liu)式(shi)檢測(ce)時(shi)，由於(yu)細(xi)胞經過(guo)了(le)培養(yang)刺(ci)激(ji)活化的(de)處(chu)理，為(wei)保(bao)證(zheng)測得結(jie)果的準(zhun)確性和(he)客觀(guan)性，除(chu)了(le)同型(xing)對照(zhao)外(wai)，還(hai)需另(ling)設(she)置未刺(ci)激(ji)對照(zhao)和(he)刺(ci)激(ji)對照(zhao)。

未刺(ci)激(ji)對照(zhao)：激活時由於(yu)BFA等的存在(zai)抑制(zhi)了(le)胞內蛋白的(de)轉運，因(yin)此在(zai)激活過(guo)程(cheng)中產生(sheng)的(de)抗原與細(xi)胞因(yin)子會滯(zhi)留胞內，未刺(ci)激(ji)對照(zhao)也應(ying)包含BFA等阻斷劑。

激(ji)活對照(zhao)：激活對照(zhao)使用細(xi)胞表(biao)面(mian)表(biao)達(da)CD69來評價激活與否，如(ru)果(guo)未達(da)到(dao)CD69期望(wang)的(de)水(shui)平(ping)，則激活步驟出(chu)了(le)問題(ti)，某(mou)壹(yi)試劑可能(neng)失活，過(guo)期，制(zhi)備(bei)不(bu)當(dang)或(huo)溶(rong)劑(ji)汙(wu)染，需制(zhi)備(bei)新鮮(xian)刺(ci)激(ji)劑(ji)重(zhong)新實(shi)驗。

間接(jie)免(mian)疫熒(ying)光標記(ji)法(fa)如(ru)何(he)設(she)置同(tong)型對照(zhao)？

答：同(tong)型對照(zhao)的目(mu)的是(shi)消(xiao)除(chu)由(you)於(yu)抗體非特(te)異(yi)性結合到(dao)細(xi)胞表(biao)面(mian)而(er)產(chan)生(sheng)的(de)背景(jing)染色(se)，而(er)確保(bao)檢測(ce)結(jie)果的(de)真實(shi)性。在(zai)采(cai)用間(jian)接免(mian)疫熒(ying)光標記(ji)法(fa)流(liu)式(shi)檢測(ce)時(shi)，所設(she)的同(tong)型對照(zhao)是(shi)與壹(yi)抗相同(tong)劑(ji)量、相同亞型和(he)相(xiang)同(tong)生(sheng)物素(su)標記(ji)（或(huo)純(chun)化）免(mian)疫球(qiu)蛋白，之後的(de)熒(ying)光標記(ji)過(guo)程(cheng)與實(shi)驗檢測(ce)組(zu)相同(tong)即(ji)可。BioLegend公(gong)司(si)提(ti)供(gong)了(le)各(ge)色(se)標記(ji)和(he)純(chun)化的(de)同型(xing)對照(zhao)免(mian)疫球(qiu)蛋白。

為(wei)什麽流(liu)式(shi)細(xi)胞術多(duo)色(se)分析(xi)時要進(jin)行(xing)熒(ying)光補償(chang)調(tiao)整？

答(da)：在(zai)進行(xing)流(liu)式(shi)細(xi)胞術多(duo)色(se)分析(xi)時,待測(ce)細(xi)胞通常(chang)攜(xie)帶兩(liang)種或(huo)兩(liang)種(zhong)以(yi)上(shang)的熒(ying)光素,如(ru)異(yi)硫(liu)氰熒(ying)光素（FITC）、藻(zao)紅(hong)蛋白（PE）、別(bie)藻紅(hong)蛋白（PECY5）等(deng)。這些熒(ying)光素被(bei)激光激發後發出不(bu)同波長的(de)熒(ying)光,理論(lun)上(shang)每(mei)壹(yi)種熒(ying)光通過(guo)選擇恰(qia)當(dang)的濾光片可被(bei)相應(ying)的(de)檢測(ce)器(qi)檢測(ce)到(dao),而(er)不(bu)受其(qi)他(ta)熒(ying)光的幹(gan)擾。但(dan)目(mu)前這些熒(ying)光染料(liao)都具有寬(kuan)發射(she)譜(pu)性質,盡(jin)管它(ta)們(men)的(de)發射(she)峰(feng)各(ge)不(bu)相同,但(dan)發射(she)譜(pu)範(fan)圍有壹(yi)定的重(zhong)疊,也就(jiu)是(shi)說,相鄰(lin)的檢測(ce)器(qi)會檢測(ce)到(dao)彼此(ci)的(de)熒(ying)光信號(hao),例如(ru),FITC檢測(ce)器(qi)會檢測(ce)到(dao)少量的PE光譜(pu),而(er)PE檢測(ce)器(qi)會檢測(ce)到(dao)較多(duo)的FITC光(guang)譜(pu)。這(zhe)樣就(jiu)影響了(le)檢測(ce)結(jie)果的(de)準(zhun)確性,因此,多色(se)分析(xi)時必須進行(xing)光譜(pu)重(zhong)疊的校(xiao)正。

如(ru)何(he)檢測(ce)胞內因子抗體(ti)的特(te)異(yi)性？

答：可以(yi)應(ying)用過(guo)量的相應(ying)細(xi)胞因(yin)子先(xian)封(feng)閉該胞內因子的熒(ying)光標記(ji)抗(kang)體(ti)，或(huo)者先(xian)用不(bu)帶熒(ying)光標記(ji)的(de)相(xiang)應(ying)因(yin)子抗體(ti)先(xian)封(feng)閉細(xi)胞，進(jin)壹(yi)步流(liu)式(shi)操(cao)作(zuo)作對照(zhao)；另外(wai)同(tong)型(xing)對照(zhao)也可以(yi)判(pan)斷細(xi)胞的(de)固定、破(po)膜(mo)的效果以(yi)及(ji)非特(te)異(yi)性背景(jing)的影(ying)響。

為什(shen)麽用CD45αSSC設(she)門法(fa)進行流(liu)式(shi)細(xi)胞術白(bai)血(xue)病(bing)表(biao)型(xing)分析(xi)？

答:免(mian)疫分型(xing)所用的(de)樣本通常(chang)是(shi)骨髓(sui),由於(yu)骨髓(sui)中各(ge)種(zhong)大(da)小(xiao)和(he)分化程(cheng)度的細(xi)胞均(jun)有,只根據(ju)細(xi)胞大(da)小(xiao)和(he)顆(ke)粒(li)密(mi)度(du)很難(nan)將不(bu)同組(zu)分的(de)細(xi)胞區分開(kai)。而(er)造(zao)血(xue)系統(tong)細(xi)胞的(de)CD45表(biao)達(da)的熒(ying)光強度(du)（FI）與細(xi)胞分化程(cheng)度有壹(yi)定關系(xi),即(ji)分化程(cheng)度高的(de)成(cheng)熟(shu)白細(xi)胞其(qi)CD45的(de)FI也高,分化程(cheng)度低(di)的(de)細(xi)胞其(qi)FI也低(di),而(er)紅(hong)系(xi)細(xi)胞的(de)FIzui低(di)。在(zai)成熟(shu)白細(xi)胞中,各(ge)類(lei)細(xi)胞其(qi)CD45的(de)FI亦不(bu)相同,其(qi)中淋巴細(xi)胞和(he)單核細(xi)胞的(de)FI高於(yu)中性粒(li)細(xi)胞。因(yin)此,根據(ju)各(ge)類(lei)細(xi)胞CD45的(de)FI和(he)顆(ke)粒(li)密(mi)度(du)不(bu)同,采(cai)用CD452SSC（側(ce)向(xiang)角(jiao)散射(she)）設(she)門法(fa)可以(yi)將原始(shi)細(xi)胞（低(di)FI,低(di)或(huo)高SSC）、淋(lin)巴細(xi)胞（高FI,低(di)SSC）、單核細(xi)胞（高FI,中等SSC）、中性粒(li)細(xi)胞（低(di)FI,高SSC）、紅(hong)系(xi)細(xi)胞（zui低(di)FI,低(di)或(huo)高SSC）和(he)細(xi)胞碎片(pian)（zui低(di)FI,zui低(di)SSC）清(qing)楚(chu)地(di)區分開(kai)。