壹般(ban)細(xi)胞(bao)的(de)凍存(cun)

（壹(yi)）細胞(bao)凍存(cun)

1. 配制含10%DMSO或(huo)甘(gan)油(you)、10～20%小(xiao)牛(niu)血清的(de)凍存(cun)培養液；

2. 取對(dui)數(shu)生(sheng)長(chang)期的(de)細(xi)胞，用(yong)胰蛋(dan)白酶把(ba)單層(ceng)生(sheng)長(chang)的(de)細(xi)胞消(xiao)化下來，懸浮生(sheng)長(chang)的(de)細(xi)胞則(ze)直(zhi)接將細(xi)胞(bao)移(yi)至15ml離心(xin)管(guan)中、；

3. 離心(xin)1000rpm，5min；

4. 去除(chu)胰蛋(dan)白酶及舊(jiu)的(de)培(pei)養液，加(jia)入(ru)適量配制好的(de)凍存(cun)培養液，用(yong)吸管(guan)輕輕吹打(da)使(shi)細(xi)胞均勻(yun)，計數，調(tiao)節(jie)凍存(cun)液中(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)zui終密度為5×106/ml～1×107/ml；

5. 將(jiang)細(xi)胞(bao)分裝(zhuang)入凍存(cun)管(guan)中，每管(guan)1～1.5 ml；

6. 在(zai)凍存(cun)管(guan)上標明細(xi)胞的(de)名(ming)稱，凍存(cun)時(shi)間及操作者(zhe)；

7. 凍存(cun)：標準的(de)凍存(cun)程序(xu)為(wei)降(jiang)溫(wen)速(su)率(lv)-1～-2℃/ min；當(dang)溫(wen)度達(da)-25℃以(yi)下(xia)時(shi)，可增(zeng)至-5℃～-10℃/

min；到-100℃時(shi)，則(ze)可迅(xun)速(su)浸(jin)入液(ye)氮中(zhong)。也(ye)可將(jiang)裝有細胞的(de)凍存(cun)管(guan)放(fang)入-20℃冰(bing)箱(xiang)2h ，然(ran)後(hou)放(fang)入-70℃冰(bing)箱(xiang)中(zhong)至明天，取出(chu)凍存(cun)管(guan)，移(yi)入(ru)液氮容(rong)器內(nei)。

（二） 細胞復(fu)蘇(su)

1. 從(cong)液(ye)氮容(rong)器中(zhong)取出(chu)凍存(cun)管(guan)，直(zhi)接浸(jin)入37℃溫(wen)水(shui)中，並(bing)不時(shi)搖動(dong)令(ling)其盡快融化。

2. 從37℃水(shui)浴中(zhong)取出(chu)凍存(cun)管(guan)，打(da)開蓋(gai)子(zi)，用(yong)吸管(guan)吸出(chu)細胞(bao)懸液，加(jia)到(dao)離心(xin)管(guan)並滴加(jia)10倍(bei)以上培養液，混(hun)勻(yun)；

3. 離心(xin)， 1000rpm，5min；

4. 棄(qi)去上(shang)清液，加(jia)入(ru)含10%小(xiao)牛(niu)血清培養液重(zhong)懸細胞，計數，調(tiao)整細(xi)胞(bao)密度(du)，接(jie)種培養瓶，37℃培(pei)養箱(xiang)靜(jing)置(zhi)培(pei)養；

5. 次日更(geng)換(huan)壹次培養液，繼(ji)續(xu)培養。