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在(zai)發(fa)展中求(qiu)生存(cun)，不(bu)斷(duan)完(wan)善，以(yi)良好(hao)信譽(yu)和科學(xue)的管(guan)理促進企業迅(xun)速(su)發(fa)展
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SYSY
上(shang)海乾(qian)思(si)生物(wu)SYSY品(pin)牌(pai)代理專業經營(ying)進口胎(tai)牛血清(qing)、細(xi)胞因(yin)子(zi)、ELISA試劑盒、細胞(bao)、抗體、生物(wu)試(shi)劑、耗(hao)材(cai)、培(pei)養基、壹(yi)抗、二抗、其產品吸(xi)附均(jun)勻，吸(xi)附性(xing)好(hao)，空白值低，孔(kong)底(di)透(tou)明度高，代做(zuo)ELISA實驗等。完(wan)善的庫(ku)存(cun)及供(gong)應體系以(yi)及(ji)高效(xiao)穩(wen)定(ding)的純化(hua)技(ji)術(shu)，保(bao)證(zheng)產品(pin)均(jun)能(neng)現(xian)貨(huo)供(gong)應和產品質量(liang)的穩(wen)定(ding)性(xing)。
怎樣查到(dao)壹(yi)個(ge)特(te)定(ding)細(xi)胞(bao)株(zhu)的相(xiang)關知(zhi)識(shi)和培養條件(jian)？
ATCC（American Type Culture Collection）收(shou)集(ji)了(le)絕(jue)大(da)多(duo)數(shu)細(xi)胞的詳(xiang)細(xi)資(zi)料。打開ATCC網(wang)頁(ye)的Cells and hybridomas鏈(lian)接(jie)，輸(shu)入細胞(bao)名稱(cheng)就(jiu)可(ke)以(yi)搜(sou)索(suo)ATCC的細(xi)胞(bao)數(shu)據庫(ku)。數(shu)據庫(ku)中有每壹(yi)種細(xi)胞的詳(xiang)細(xi)描(miao)述，包括細胞(bao)的來源，培養和凍存條件(jian)，以(yi)及(ji)相(xiang)關文(wen)獻等(deng)資(zi)料。
如何選(xuan)用特殊(shu)細胞(bao)系培養基？
培(pei)養某類(lei)型(xing)細(xi)胞(bao)沒(mei)有固(gu)定(ding)的培(pei)養條件(jian)。MEM中培養的細(xi)胞(bao)，很可(ke)能(neng)在DMEM或M199中同樣容易生長(chang)。總(zong)之，*MEM、DMEM做(zuo)貼(tie)壁細胞(bao)培(pei)養；RPMI1640做(zuo)懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)培(pei)養；各種(zhong)目(mu)的無(wu)血清(qing)培(pei)養*AIMV培養基（SFM）。
測(ce)序(xu)實(shi)驗(yan)流(liu)程：
1 收(shou)集(ji)樣(yang)品
2 相(xiang)關試(shi)劑 總(zong)RNA提取試劑TREzol Reagent (RNA提取試劑), M-MLV(cDNA逆(ni)轉(zhuan)錄酶), RNA 純化(hua)試(shi)劑, RealqPCR MasterMix (熒(ying)光定(ding)量(liang)PCR預混試劑)。
3 實(shi)驗儀(yi)器(qi) 熒(ying)光定(ding)量(liang)PCR儀; PCR儀(yi);低溫(wen)離心機。
4 總RNA提取
5 cDNA合成(cheng) 在0.5ml的離心管中加入1µl模板(ban)總(zong)RNA(1µg/µl); 2µl隨(sui)機引物(wu)(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加(jia)水(shui)至15µl體(ti)系。混勻後70℃變性(xing)RNA 5分(fen)鐘，冰上速(su)冷(leng)1分(fen)鐘，離心將(jiang)溶(rong)液(ye)收(shou)集(ji)至(zhi)管底(di)加(jia)入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水(shui)至30µl體(ti)系。PCR儀中反應條(tiao)件(jian)設(she)置(zhi) 37℃延(yan)伸(shen)60min，70℃保(bao)溫(wen)15min終止反應。合成(cheng)好(hao)的cDNA置(zhi)於(yu) -20 ℃保(bao)存(cun)備用。
6 引物(wu)設(she)計與thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成(cheng)
7 實時(shi)定(ding)量(liang)PCR 按以(yi)下(xia)反應體(ti)系進行(xing): 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上遊(you)引(yin)物(wu)F 1 ul，下(xia)遊(you)引(yin)物(wu)R 1 ul;cDNA template 2ul。定(ding)量(liang)PCR儀擴(kuo)增(zeng)反應條(tiao)件(jian)設(she)置(zhi):50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40個(ge)循環)。
8 PCR產物(wu)溶(rong)解(jie)曲線分(fen)析 將(jiang)所(suo)擴(kuo)增(zeng)的PCR 產(chan)物(wu)進行(xing)溶(rong)解(jie)曲線分(fen)析，單峰溶(rong)解(jie)曲線表(biao)示(shi)擴(kuo)增(zeng)產(chan)物(wu)單(dan)壹(yi)，無非(fei)特異性(xing)擴(kuo)增(zeng)產(chan)物(wu)。溶(rong)解(jie)曲線生成(cheng)的反應程序為(wei): 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。
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