RAG小(xiao)鼠(shu)腎(shen)腺癌細胞系
RAG小(xiao)鼠(shu)腎(shen)腺癌細胞系源自 RAG 基因敲(qiao)除(chu)小鼠(shu)的(de)自發(fa)性(xing)腎腺(xian)癌(ai)，因(yin) RAG1/2 基(ji)因(yin)缺(que)失(shi)導(dao)致(zhi) T、B 淋(lin)巴(ba)細胞發(fa)育(yu)障礙(ai)，成為(wei)兼具腫瘤(liu)特(te)性(xing)與免疫缺(que)陷(xian)背景(jing)的(de)du特(te)研(yan)究(jiu)模(mo)型(xing)。其(qi)在腎癌(ai)發(fa)病(bing)機制(zhi)、免疫逃(tao)逸(yi)及(ji)細胞治(zhi)療(liao)研(yan)究(jiu)中(zhong)展現(xian)出(chu)不(bu)可(ke)替代(dai)的(de)價值，為(wei)連接腫(zhong)瘤(liu)生物學與免疫缺(que)陷(xian)模(mo)型(xing)搭(da)建了關鍵(jian)橋(qiao)梁。
顯微(wei)鏡(jing)下，該細胞呈貼(tie)壁生(sheng)長，形態以(yi)多邊形和上皮(pi)樣(yang)為(wei)主(zhu)，宛(wan)如覆蓋(gai)在培(pei)養(yang)皿表面的(de) “不規則鱗(lin)片"。細胞直徑(jing)約 18-25 微(wei)米(mi)，較普通腎(shen)小(xiao)管上皮(pi)細胞略大(da)；胞質豐富，可(ke)見散在的(de)脂滴(di)樣(yang)空泡 —— 這是腎腺癌(ai)的(de)典型(xing)胞質特(te)征；細胞核呈(cheng)橢(tuo)圓形或不(bu)規則形，核質比(bi)約(yue) 1:2，染色質呈(cheng)粗(cu)顆(ke)粒狀(zhuang)，核仁(ren)清晰(xi)（1-2 個），偶見雙(shuang)核細胞，顯示(shi)出腫(zhong)瘤(liu)細胞的(de)異(yi)型(xing)性(xing)。細胞增殖(zhi)速(su)度中(zhong)等(deng)，倍(bei)增(zeng)時(shi)間約 48-60 小(xiao)時，當融合度達(da) 80%-90% 時(shi)需(xu)傳代(dai)，傳代(dai)時(shi)通過(guo)溫和吹(chui)打(da)結(jie)合(he)短時(shi) EDTA 處理(li)使細胞脫落，按(an) 1:4 比(bi)例接(jie)種(zhong)，連續培(pei)養(yang) 40 代(dai)仍能(neng)保持穩(wen)定的(de)腫瘤(liu)表型(xing)。
培(pei)養(yang) RAG 小(xiao)鼠(shu)腎(shen)腺癌細胞需模(mo)擬(ni)腎(shen)臟微環境。基(ji)礎培(pei)養(yang)基(ji)選用(yong) DMEM/F12 混合液(ye)，其(qi)高糖(tang)成(cheng)分(fen)（4.5g/L）可(ke)滿足腎癌細胞的(de)能量需(xu)求(qiu)；添(tian)加 10% 胎牛血(xue)清(qing)提供生(sheng)長因(yin)子，其(qi)中(zhong)血清(qing)中(zhong)的(de)表皮(pi)生長(chang)因子（EGF）對維(wei)持細胞的(de)上皮(pi)特(te)性(xing)至關(guan)重要。培(pei)養(yang)環境需(xu)嚴格控制(zhi)在 37℃、5% CO₂，pH 值穩(wen)定在 7.3-7.5，通過(guo)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)的(de)酚紅指(zhi)示(shi)劑(ji)監(jian)測酸(suan)堿變化(hua)。與普通腎(shen)癌(ai)細胞系不(bu)同(tong)，該(gai)細胞對血(xue)清批(pi)次(ci)敏(min)感(gan)，需篩選能維(wei)持其(qi)腫(zhong)瘤(liu)標誌物（如碳酸(suan)酐酶 IX、VEGF）表(biao)達(da)的(de)血清(qing)，每(mei)批(pi)血(xue)清(qing)需(xu)經(jing) Western blot 驗證(zheng)，確保標誌物表達量波動(dong)不超過(guo) 20%。
在腎癌(ai)發(fa)病(bing)機制(zhi)研(yan)究(jiu)中(zhong)，該細胞系是(shi)解(jie)析(xi)基(ji)因突變(bian)與腫(zhong)瘤(liu)進展關(guan)系的(de)理想(xiang)工具。其(qi)保留了原發(fa)腫(zhong)瘤(liu)的(de)關鍵(jian)突變(bian)特(te)征，如 VHL 基因(yin)失(shi)活(huo) —— 這與人類(lei)透(tou)明細胞腎癌(ai)的(de)常見突變(bian)高度吻(wen)合。實(shi)驗(yan)顯(xian)示(shi)，該細胞在缺(que)氧(yang)條(tiao)件下（1% O₂）的(de) HIF-1α 蛋白(bai)穩(wen)定性(xing)顯著(zhu)提(ti)高，下遊靶(ba)基因(yin) VEGF、GLUT1 的(de)表達(da)量上調(tiao) 4-6 倍(bei)，wan美(mei)模(mo)擬(ni)了(le)腎癌的(de)缺(que)氧(yang)適應機制(zhi)。通過(guo) CRISPR 技(ji)術修(xiu)復(fu) VHL 基因(yin)後(hou)，細胞的(de)克隆(long)形成能(neng)力下降(jiang) 50%，裸鼠(shu)成(cheng)瘤(liu)體積(ji)縮小(xiao) 60%，直接(jie)證(zheng)明(ming) VHL 失活(huo)在腎癌(ai)發(fa)生(sheng)中(zhong)的(de)驅動(dong)作用(yong)。
在免疫逃(tao)逸(yi)研(yan)究(jiu)中(zhong)，RAG 小鼠(shu)腎(shen)腺癌細胞的(de)免疫缺(que)陷(xian)宿主(zhu)背景(jing)提供了du特(te)優(you)勢。由於(yu)宿主(zhu)缺(que)乏功能(neng)性(xing) T、B 細胞，可(ke)單(dan)獨(du)評(ping)估(gu)腫(zhong)瘤(liu)細胞與固(gu)有(you)免疫細胞的(de)相互(hu)作用(yong)。例如，該細胞高表達(da) PD-L1 分子，與巨(ju)噬(shi)細胞表面 PD-1 結(jie)合(he)後(hou)，可(ke)抑制(zhi)巨噬(shi)細胞的(de)吞噬活(huo)性(xing)（吞噬率(lv)下降(jiang) 35%），並(bing)誘(you)導(dao)其(qi)向(xiang) M2 型(xing)極(ji)化(hua)（IL-10 分泌(mi)增(zeng)加(jia) 2 倍(bei)）。這壹發(fa)現(xian)為(wei)腎癌 “劫(jie)持(chi)" 固(gu)有(you)免疫的(de)機制(zhi)提供(gong)了直接證(zheng)據(ju)，也(ye)解釋了(le)為(wei)何(he)部分腎(shen)癌患者(zhe)對 PD-1 抑(yi)制(zhi)劑(ji)單(dan)藥治(zhi)療(liao)響(xiang)應率低。
在細胞治(zhi)療(liao)研(yan)究(jiu)中(zhong)，該細胞系是(shi)驗(yan)證(zheng)過(guo)繼(ji)性(xing)細胞療法(fa)的(de)理想(xiang)模(mo)型(xing)。因(yin)其(qi)來(lai)源的(de)宿主(zhu)無(wu) T 細胞，可(ke)避免移植(zhi)物抗宿主(zhu)病(bing)（GVHD），直(zhi)接評估(gu)輸(shu)註(zhu)的(de) CAR-T 細胞活(huo)性(xing)。實(shi)驗(yan)顯(xian)示(shi)，靶(ba)向碳(tan)酸(suan)酐酶 IX 的(de) CAR-T 細胞與該(gai)細胞共(gong)培(pei)養(yang)時(shi)，殺(sha)傷(shang)效(xiao)率達(da) 85% 以上，且在荷瘤(liu) RAG 小鼠(shu)中(zhong)可(ke)使腫瘤(liu)體積(ji)縮小(xiao) 70%，生存(cun)期(qi)延(yan)長(chang) 2 倍(bei)。這壹模(mo)型(xing)為(wei)優化(hua) CAR-T 細胞的(de)抗原靶(ba)點和(he)輸(shu)註(zhu)劑(ji)量提(ti)供(gong)了可(ke)靠(kao)的(de)實(shi)驗(yan)數(shu)據。
在藥物篩選領(ling)域，該(gai)細胞系可(ke)用(yong)於(yu)評估(gu)免疫聯合療法的(de)效果(guo)。例如，將抗血管生成(cheng)藥物（如舒尼(ni)替(ti)尼(ni)）與 PD-L1 抗體聯用(yong)，通過(guo)檢測細胞分泌(mi)的(de)細胞因子（如 IFN-γ、TNF-α）和腫(zhong)瘤(liu)微環境中(zhong)的(de)血管(guan)密度(du)，發(fa)現(xian)聯合治(zhi)療(liao)可(ke)使腫瘤(liu)壞死(si)面積(ji)增加(jia) 40%，遠(yuan)高於(yu)單(dan)藥治(zhi)療(liao)（15%-20%）。這種(zhong) “抗血管 + 免疫" 的(de)協同(tong)效(xiao)應在該模(mo)型(xing)中(zhong)得(de)到清晰(xi)驗證(zheng)，為(wei)臨(lin)床(chuang)方案(an)優(you)化(hua)提供(gong)參考(kao)。
培(pei)養(yang)過(guo)程中(zhong)，需特(te)別(bie)註(zhu)意該(gai)細胞的(de)貼(tie)壁依賴(lai)性(xing)較強(qiang)，傳代(dai)時(shi)避免過(guo)度消化(hua)導(dao)致(zhi)細胞損傷(shang)。凍(dong)存(cun)時(shi)使用(yong)含(han) 15% DMSO 的(de)血清(qing)凍(dong)存(cun)液(ye)，采用(yong)程序(xu)降(jiang)溫盒降(jiang)至 - 80℃後(hou)轉(zhuan)入(ru)液氮(dan)，復(fu)蘇存(cun)活(huo)率可(ke)達 75% 以上。與普通腎(shen)癌(ai)細胞系相(xiang)比(bi)，其(qi)對hua療(liao)藥物（如shun鉑(bo)）敏感性(xing)較低，IC50 值約為(wei)普通細胞的(de) 2 倍(bei)，這與其(qi)高表達(da) ABC 轉(zhuan)運(yun)蛋(dan)白（如 ABCG2）有(you)關，為(wei)研(yan)究(jiu)腎(shen)癌(ai)耐藥機制(zhi)提供(gong)了天(tian)然模(mo)型(xing)。
前(qian)沿(yan)研(yan)究(jiu)中(zhong)，該細胞系的(de)應用(yong)持續拓(tuo)展。在類器(qi)官構(gou)建(jian)中(zhong)，將其(qi)與(yu)腎(shen)間質細胞共(gong)培(pei)養(yang)，可(ke)形成具有(you)腎小(xiao)管樣(yang)結(jie)構(gou)的(de)三維(wei)腫(zhong)瘤(liu)模(mo)型(xing)，用(yong)於(yu)研(yan)究(jiu)腫(zhong)瘤(liu) - 基質相(xiang)互(hu)作用(yong)對藥物響應的(de)影響(xiang)；在單(dan)細胞測序(xu)中(zhong)，解析(xi)其(qi)異(yi)質性(xing)亞群(qun)，發(fa)現(xian)高表達(da) CD133 的(de)細胞亞群(qun)具有(you)更(geng)強(qiang)的(de)成瘤(liu)能力和耐藥性(xing)，為(wei)識別(bie)腎癌(ai)幹(gan)細胞提供(gong)了(le)標(biao)誌物；在基因(yin)編(bian)輯領(ling)域，通(tong)過(guo)敲(qiao)入(ru)熒(ying)光素(su)酶(mei)基因，可(ke)實(shi)時(shi)監(jian)測荷瘤(liu)小鼠(shu)的(de)腫瘤(liu)生長(chang)動(dong)態，為(wei)評估(gu)藥物的(de)體內(nei)療(liao)效(xiao)提(ti)供可(ke)視(shi)化(hua)工具。
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