hTERT-LSC羔(gao)羊睪丸(wan)支(zhi)持(chi)細(xi)胞永生化(hua)細(xi)胞系(xi)
hTERT-LSC羔(gao)羊睪丸(wan)支(zhi)持(chi)細(xi)胞永生化(hua)細(xi)胞系(xi)作為通過端(duan)粒(li)酶逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶（hTERT）介導(dao)永生化(hua)的特(te)異(yi)性(xing)細(xi)胞模(mo)型，在反(fan)芻動(dong)物生(sheng)殖(zhi)發(fa)育(yu)機(ji)制(zhi)、細(xi)胞永生化(hua)調(tiao)控(kong)及雄(xiong)性(xing)生殖疾(ji)病(bing)研(yan)究領域(yu)具(ju)有裏(li)程(cheng)碑式(shi)的價值(zhi)。它(ta)的建立(li)突破(po)了(le)原代(dai)支持(chi)細(xi)胞傳代(dai)有限(xian)的瓶頸，為長(chang)期(qi)追(zhui)蹤羔(gao)羊睪丸(wan)支(zhi)持(chi)細(xi)胞的分化(hua)規(gui)律、生(sheng)精(jing)微環(huan)境穩態(tai)維(wei)持(chi)及(ji)永生化(hua)相(xiang)關(guan)信號(hao)通路研(yan)究提(ti)供了(le)穩定(ding)的體(ti)外平(ping)臺，對揭(jie)示反(fan)芻動(dong)物生(sheng)殖(zhi)細(xi)胞與(yu)支持(chi)細(xi)胞互(hu)作機(ji)制(zhi)及(ji)繁(fan)育(yu)技術創新意(yi)義(yi)深遠(yuan)。
睪丸(wan)支(zhi)持(chi)細(xi)胞的體(ti)外研(yan)究長(chang)期(qi)受(shou)限(xian)於(yu)原代(dai)細(xi)胞傳代(dai)次數(shu)少(shao)（通(tong)常(chang)不超(chao)過(guo) 15 代(dai)）、增殖(zhi)能(neng)力(li)隨傳代(dai)逐漸(jian)衰(shuai)退等(deng)問(wen)題(ti)，難以開展長(chang)期(qi)實驗(yan)及(ji)穩定(ding)的功能(neng)驗(yan)證。hTERT 作為調(tiao)控(kong)端粒(li)長(chang)度(du)的關(guan)鍵因(yin)子，通(tong)過導(dao)入該(gai)基(ji)因可使細(xi)胞突破(po)增殖(zhi)極限(xian)，實(shi)現永生化(hua)同(tong)時(shi)保(bao)留(liu)原有生(sheng)物(wu)學特(te)性(xing)。羔(gao)羊階(jie)段(duan)的支持(chi)細(xi)胞處(chu)於增(zeng)殖(zhi)分(fen)化(hua)關(guan)鍵期(qi)，其永生化(hua)細(xi)胞系(xi)的建立(li)不僅解決(jue)了(le)材(cai)料(liao)獲(huo)取(qu)的局(ju)限(xian)性(xing)，更(geng)能(neng)精(jing)準模(mo)擬青(qing)春(chun)期(qi)前睪丸(wan)支(zhi)持(chi)細(xi)胞的生理(li)狀態，為(wei)解析反(fan)芻動(dong)物生(sheng)殖(zhi)系(xi)統發育(yu)的時(shi)間(jian)依賴(lai)性(xing)規律提(ti)供了(le)獨(du)te工具(ju)。
hTERT-LSC 細(xi)胞系(xi)的建立(li)采(cai)用(yong)嚴謹的基(ji)因編輯與(yu)細(xi)胞培(pei)養技術結合(he)的方(fang)案。從健康(kang)新(xin)生羔(gao)羊睪丸(wan)組(zu)織(zhi)中分(fen)離原代(dai)支持(chi)細(xi)胞，通(tong)過免疫磁珠分選(xuan)（利(li)用 CD90 特(te)異(yi)性(xing)標(biao)誌(zhi)物(wu)）獲(huo)得(de)高(gao)純度(du)細(xi)胞群。采(cai)用(yong)慢(man)病(bing)毒載體(ti)將 hTERT 基(ji)因導(dao)入原代(dai)細(xi)胞，經(jing)嘌呤黴素(su)篩(shai)選獲(huo)得(de)穩定(ding)表(biao)達株。陽性(xing)克隆(long)接(jie)種於(yu)含(han) 10% 胎(tai)牛血清(qing)的 DMEM/F12 培養液(ye)中，在 37℃、5% CO₂培(pei)養箱(xiang)中培養，每 24 小(xiao)時(shi)換液(ye)壹次。待(dai)細(xi)胞匯合(he)度(du)達(da) 80% 時(shi)進行傳代(dai)，目前已連續傳代(dai)超(chao)過(guo) 100 代(dai)，細(xi)胞活(huo)力(li)仍(reng)保(bao)持(chi)在 90% 以上，顯著優(you)於原代(dai)細(xi)胞（傳代(dai) 15 代(dai)後(hou)活(huo)力(li)降至(zhi) 50% 以下）。
該(gai)細(xi)胞系(xi)保(bao)留(liu)典(dian)型的不規則(ze)星(xing)形形態(tai)，胞(bao)體(ti)伸展呈多(duo)角(jiao)狀，胞質突起(qi)豐(feng)富(fu)且相(xiang)互(hu)連接形成(cheng)網(wang)狀結構，細(xi)胞核(he)呈圓形居(ju)中，核(he)仁(ren)清(qing)晰(xi)可見(jian)。與原代(dai) LSC 細(xi)胞相(xiang)比(bi)，永生化(hua)細(xi)胞體(ti)積略大，增殖(zhi)速(su)率提高(gao)約 30%，群體(ti)倍(bei)增時(shi)間(jian)縮(suo)短至(zhi) 60 小(xiao)時(shi)。核型分析(xi)顯示，傳代(dai) 100 代(dai)後(hou)仍(reng)保(bao)持(chi)羔(gao)羊正常(chang)染(ran)色(se)體(ti)數目，hTERT 基(ji)因穩定(ding)整(zheng)合(he)於(yu)基(ji)因組中，端粒(li)長(chang)度(du)維(wei)持(chi)在 5-8kb（原代(dai)細(xi)胞傳代(dai) 15 代(dai)後(hou)端(duan)粒(li)縮短至(zhi) 2kb 以下）。免(mian)疫(yi)熒(ying)光檢(jian)測(ce)證實，細(xi)胞高(gao)表(biao)達波(bo)形蛋(dan)白(bai)、轉(zhuan)鐵蛋(dan)白(bai)等(deng)支(zhi)持(chi)細(xi)胞特(te)異(yi)性(xing)標(biao)誌(zhi)物(wu)，且表達(da)水(shui)平與原代(dai)細(xi)胞無(wu)顯著差(cha)異(yi)，表(biao)明永生化(hua)過(guo)程未改(gai)變(bian)其(qi)細(xi)胞屬(shu)性(xing)。
在功(gong)能(neng)特(te)性(xing)方(fang)面(mian)，hTERT-LSC 細(xi)胞系(xi)展現出更(geng)穩定(ding)的生殖(zhi)支持(chi)功(gong)能(neng)。ELISA 檢(jian)測(ce)顯示，其分泌(mi)的雄(xiong)激(ji)素(su)結合(he)蛋(dan)白(bai)（ABP）濃度(du)穩定(ding)在 28ng/mL，顯著高(gao)於(yu)傳代(dai)後(hou)期(qi)的原代(dai)細(xi)胞（12ng/mL），且連續傳代(dai) 50 代(dai)後(hou)分(fen)泌能(neng)力(li)無(wu)明顯下降。與(yu)精(jing)原細(xi)胞共(gong)培養實(shi)驗(yan)表(biao)明，該細(xi)胞系(xi)可使精(jing)原細(xi)胞存(cun)活率提高(gao) 45%，促(cu)進其向初級(ji)精(jing)母細(xi)胞分(fen)化(hua)的比(bi)例達(da) 30%，效果優(you)於原代(dai)細(xi)胞且重(zhong)復性(xing)更(geng)高(gao)。在永生化(hua)機(ji)制(zhi)研(yan)究中(zhong)發(fa)現，細(xi)胞中(zhong) PI3K/Akt 信號通路持(chi)續激(ji)活(huo)，p53 抑癌(ai)基(ji)因表達受(shou)到適度(du)抑制(zhi)，為解析支(zhi)持(chi)細(xi)胞永生化(hua)的分子(zi)網絡提供了(le)直接證據。此外，該(gai)細(xi)胞系(xi)對生殖系統病(bing)原體(ti)如布(bu)魯氏(shi)菌(jun)的敏感(gan)性(xing)與原代(dai)細(xi)胞壹致(zhi)，感(gan)染(ran)後(hou) 24 小(xiao)時(shi)即可(ke)觀察(cha)到典(dian)型的細(xi)胞病(bing)變(bian)，適合(he)用(yong)於(yu)長(chang)期(qi)感(gan)染(ran)模(mo)型的建立(li)。
hTERT-LSC 細(xi)胞系(xi)在多(duo)個研(yan)究領域(yu)展現出獨(du)te優(you)勢。在生(sheng)殖(zhi)發育(yu)研(yan)究中(zhong)，通(tong)過連續傳代(dai)觀察(cha)，首ci揭(jie)示了(le)羔(gao)羊支(zhi)持(chi)細(xi)胞在體(ti)外長(chang)期(qi)培養中(zhong)類固醇(chun)合(he)成(cheng)酶的動態(tai)表達規律；在永生化(hua)機(ji)制(zhi)研(yan)究中(zhong)，利(li)用該(gai)細(xi)胞系(xi)驗(yan)證了(le)端粒(li)酶與端粒(li)結合(he)蛋(dan)白(bai) TRF2 的協(xie)同(tong)調(tiao)控(kong)作用(yong)；在應用(yong)層(ceng)面(mian)，已成(cheng)功(gong)用於(yu)綿(mian)羊病(bing)毒性(xing)睪丸(wan)炎的藥物(wu)篩(shai)選，篩(shai)選出(chu) 3 種(zhong)具(ju)有顯著保(bao)護效果的化(hua)合(he)物(wu)。該(gai)細(xi)胞系(xi)的建立(li)還為其他(ta)反(fan)芻動(dong)物支(zhi)持(chi)細(xi)胞的永生化(hua)提(ti)供了(le)標(biao)準(zhun)化(hua)方(fang)案，目前已據此建(jian)立(li)了(le)牛、山羊的同(tong)源(yuan)永生化(hua)細(xi)胞系(xi)。
作為首ge穩定(ding)傳代(dai)超(chao)過(guo) 100 代(dai)的羔(gao)羊睪丸(wan)支(zhi)持(chi)細(xi)胞模(mo)型，hTERT-LSC 不僅解決(jue)了(le)原代(dai)細(xi)胞研(yan)究的局(ju)限(xian)性(xing)，更(geng)開創(chuang)了(le)反(fan)芻動(dong)物生(sheng)殖(zhi)細(xi)胞長(chang)期(qi)體(ti)外模(mo)擬的新範(fan)式(shi)。其(qi)在保(bao)持(chi)細(xi)胞原有功(gong)能(neng)特(te)性(xing)的同(tong)時(shi)實現永生化(hua)的特(te)點，為生(sheng)殖生(sheng)物(wu)學基(ji)礎研(yan)究、動(dong)物(wu)繁(fan)育(yu)技術創新及(ji)男(nan)性(xing)生殖疾(ji)病(bing)模(mo)型建立(li)提(ti)供了(le)跨物(wu)種的研(yan)究工(gong)具(ju)，對推動畜牧業(ye)可持(chi)續發(fa)展和人(ren)類(lei)生殖健(jian)康(kang)研(yan)究具(ju)有重(zhong)要的雙向(xiang)意(yi)義。
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