MPC-L2果(guo)子貍(li)肺(fei)細(xi)胞(bao)系
MPC-L2果(guo)子貍(li)肺(fei)細(xi)胞(bao)系作為果(guo)子貍(li)氣道(dao)部位(wei)的(de)特(te)異(yi)性(xing)模型(xing)，以其(qi)支氣管上皮(pi)細(xi)胞(bao)的典型(xing)表型(xing)和病(bing)毒(du)復制(zhi)相(xiang)關蛋(dan)白(bai)酶的高表達(da)特征，在冠(guan)狀病(bing)毒(du)氣道(dao)感(gan)染(ran)機制(zhi)解(jie)析(xi)、針對(dui)性(xing)藥(yao)物評價(jia)及野生動物呼(hu)吸(xi)道(dao)疫病(bing)研(yan)究(jiu)中具有(you)重(zhong)要(yao)價(jia)值。與(yu) MPC-L1 果(guo)子貍(li)肺(fei)細(xi)胞(bao)系的(de)肺(fei)泡混(hun)合(he)特性(xing)不(bu)同(tong)，該(gai)細(xi)胞(bao)系源(yuan)自(zi)果(guo)子貍(li)氣道(dao)組(zu)織(zhi)，為(wei)探(tan)索冠狀病(bing)毒(du)在氣道(dao)的(de)感(gan)染(ran)規(gui)律(lv)和(he)藥(yao)物幹預(yu)效果(guo)提(ti)供了(le)精準實驗載體(ti)。
細(xi)胞(bao)起源(yuan)與(yu)生(sheng)物學(xue)特(te)性(xing)
該(gai)細(xi)胞(bao)系源(yuan)自(zi) 1 歲(sui)健(jian)康果(guo)子貍(li)的(de)氣道(dao)組(zu)織(zhi)，通(tong)過 0.2% 膠原(yuan)酶聯(lian)合(he) 0.25% yi酶分(fen)步消化(hua)法(fa)分(fen)離支氣管上皮(pi)細(xi)胞(bao)，經角(jiao)蛋(dan)白(bai) 19（CK19）與黏(nian)液(ye)蛋(dan)白(bai) 5AC（MUC5AC）雙(shuang)標(biao)篩選（共陽性(xing)率(lv)＞98%）建立(li)。其(qi)核心特征是(shi)保留氣道(dao)組(zu)織(zhi)的(de)病(bing)毒(du)復制(zhi)特(te)性(xing)：冠(guan)狀病(bing)毒(du)刺突蛋(dan)白(bai)切(qie)割(ge)相(xiang)關的 TMPRSS2 表達(da)量(liang)為(wei) MPC-L1 細(xi)胞(bao)的 2.3 倍(bei)，而與(yu)病(bing)毒(du)復制(zhi)相(xiang)關的 NSP12 表達(da)量(liang)為(wei) MPC-L1 的(de) 1.8 倍(bei)，體(ti)現了(le)氣道(dao)作為病(bing)毒(du)復制(zhi)活躍(yue)部位(wei)的(de)分(fen)子基礎。
細(xi)胞(bao)形態呈(cheng)現(xian)支氣管上皮(pi)細(xi)胞(bao)的典型(xing)特征(zheng)：胞(bao)體(ti)呈柱(zhu)狀，長(chang)度約(yue) 20-25μm（長(chang)於(yu) MPC-L1 的(de)肺(fei)泡細(xi)胞(bao)），寬(kuan)度約(yue) 8-10μm，胞(bao)質內含有豐(feng)富(fu)的纖毛(mao)結(jie)構（掃描電(dian)鏡顯(xian)示密(mi)度為 MPC-L1 的 3.5 倍(bei)），細(xi)胞(bao)核呈(cheng)橢圓形（核質比(bi)約(yue) 1:3.8），排(pai)列(lie)呈假(jia)復層(ceng)結(jie)構，與果(guo)子貍(li)氣道(dao)組(zu)織(zhi)切(qie)片(pian)的(de)支(zhi)氣管上皮(pi)細(xi)胞(bao)形態吻(wen)合(he)度達(da) 97%。培養(yang)體(ti)系需(xu)模擬氣道(dao)微(wei)環(huan)境(jing)：含 12% 胎(tai)牛(niu)血(xue)清的 DMEM/F12 培(pei)養(yang)基(ji)（添(tian)加(jia) 10ng/mL 表皮(pi)生長(chang)因(yin)子(zi)），在 37℃、5% CO₂、90% 濕度環境下(xia)貼(tie)壁(bi)生(sheng)長(chang)，倍(bei)增(zeng)時(shi)間(jian)約(yue) 50-54 小時(shi)（快(kuai)於 MPC-L1）。傳(chuan)代需(xu)在細(xi)胞(bao)融合(he)度達(da) 75% 時(shi)進行(xing)，采用(yong) 1:3 比例接(jie)種(zhong)，在 12% 氧濃度（氣道(dao)生(sheng)理(li)氧分(fen)壓）環境(jing)下(xia)活性(xing)保持率(lv)達(da) 89%（MPC-L1 為 85%），顯(xian)示出(chu)對(dui)氣道(dao)氧環境(jing)的良(liang)好適(shi)應能(neng)力。
功能(neng)驗證(zheng)顯(xian)示，該(gai)細(xi)胞(bao)系保留關鍵的(de)氣道(dao)功能(neng)：黏(nian)液(ye)分(fen)泌量(liang)達(da) 35μg/(10⁶細(xi)胞(bao)・24h)（MPC-L1 為 18μg），病(bing)毒(du)復制(zhi)效(xiao)率(lv)為(wei) MPC-L1 的 1.6 倍(bei)；連續(xu)傳(chuan)代 30 次後核(he)型(xing)穩定(ding)（44 條染色(se)體(ti)，含果(guo)子貍(li)特(te)異性(xing)染(ran)色體(ti)標(biao)記），無微(wei)生(sheng)物汙(wu)染，病(bing)毒(du)復制(zhi)相(xiang)關表型(xing)保留率(lv)達(da) 93%（略高於 MPC-L1 的 91%），為長期(qi)氣道(dao)感(gan)染(ran)及(ji)藥(yao)物評價(jia)研(yan)究(jiu)提(ti)供了(le)穩定性(xing)保障。
核心應用(yong)領域
冠狀病(bing)毒(du)氣道(dao)感(gan)染(ran)機制(zhi)研(yan)究(jiu)
MPC-L2 細(xi)胞(bao)系是(shi)解(jie)析(xi)冠狀病(bing)毒(du)在氣道(dao)復制(zhi)機制(zhi)的(de)理(li)想(xiang)工(gong)具。在 SARS-CoV-2 感(gan)染(ran)研(yan)究(jiu)中，該細(xi)胞(bao)系表現出(chu)顯(xian)著的(de)氣道(dao)特(te)異(yi)性(xing)：病(bing)毒(du)刺突蛋(dan)白(bai)在細(xi)胞(bao)表面的(de)切(qie)割(ge)效(xiao)率(lv)為(wei) MPC-L1 的 2.8 倍(bei)，且病(bing)毒(du)釋(shi)放量(liang)為(wei) MPC-L1 的(de) 2.1 倍(bei)。通(tong)過該模型(xing)發(fa)現，果(guo)子貍(li)支(zhi)氣管上皮(pi)細(xi)胞(bao)的 TMPRSS2 與(yu) CK19 存(cun)在相(xiang)互(hu)作用(yong)（Co-IP 驗證(zheng)），這(zhe)種相互(hu)作用(yong)可使(shi) TMPRSS2 的活性(xing)提(ti)升 40%，從(cong)而高效切(qie)割(ge)病(bing)毒(du)刺突蛋(dan)白(bai)，促(cu)進(jin)病(bing)毒(du)進(jin)入(ru)細(xi)胞(bao)。與 MPC-L1 細(xi)胞(bao)對(dui)比顯(xian)示，MPC-L2 細(xi)胞(bao)的病(bing)毒(du)傳(chuan)播方式更(geng)具氣道(dao)特(te)點(dian) —— 通(tong)過細(xi)胞(bao)間(jian)接(jie)觸(chu)傳(chuan)播的(de)比例(li)達(da) 65%（MPC-L1 為 35%），且釋放的病(bing)毒(du)在黏(nian)液(ye)中存(cun)活時(shi)間(jian)延(yan)長至 24 小時(shi)（MPC-L1 為 12 小時(shi)），揭示(shi)了(le)氣道(dao)作為病(bing)毒(du)傳(chuan)播重(zhong)要(yao)源(yuan)頭(tou)的(de)生(sheng)物學(xue)基(ji)礎。
抗病(bing)du藥(yao)物評價(jia)
在藥(yao)物評價(jia)應用(yong)中，該細(xi)胞(bao)系的(de)氣道(dao)特(te)異(yi)性(xing)特(te)征凸(tu)顯(xian)優(you)勢(shi)。采用(yong) MPC-L2 建立(li)的(de)藥(yao)物評價(jia)模型(xing)顯(xian)示，針對(dui) TMPRSS2 的藥(yao)物抑制(zhi)率(lv)比(bi) MPC-L1 高 42%，而針對(dui) RdRp 的藥(yao)物抑制(zhi)率(lv)與(yu) MPC-L1 相當(dang)（偏差(cha)＜5%），準確反映(ying)了(le)不(bu)同(tong)藥(yao)物在氣道(dao)的(de)作用(yong)效果(guo)。通(tong)過該模型(xing)評價(jia)發(fa)現，卡莫司(si)他(ta)在 MPC-L2 中(zhong)的(de) EC₅₀值（0.8μM）與(yu)動物氣道(dao)感(gan)染(ran)模型(xing)結(jie)果(guo)（0.7μM）偏差(cha)僅(jin) 12%，而在 MPC-L1 中(zhong)偏(pian)差(cha)達(da) 35%。與 MPC-L1 對(dui)比顯(xian)示，MPC-L2 對(dui)黏(nian)膜吸(xi)收(shou)類(lei)藥(yao)物的響應(ying)更(geng)敏感：霧(wu)化(hua)給藥(yao)方式下(xia)的(de)藥(yao)物抑制(zhi)率(lv)比(bi) MPC-L1 高 38%，更貼(tie)合(he)臨床氣道(dao)給藥(yao)的實(shi)際(ji)情況(kuang)，為(wei)藥(yao)物的給藥(yao)方式選擇(ze)提(ti)供了(le)重要(yao)參(can)考(kao)。
冠(guan)狀病(bing)毒(du)氣道(dao)免(mian)疫逃(tao)逸機制(zhi)研(yan)究(jiu)
該細(xi)胞(bao)系為(wei)探(tan)索冠狀病(bing)毒(du)在氣道(dao)的(de)免(mian)疫逃(tao)逸策略提(ti)供了(le)重要(yao)平臺。在免(mian)疫應(ying)答(da)研(yan)究(jiu)中，MPC-L2 細(xi)胞(bao)的 TLR7 表達(da)量(liang)為(wei) MPC-L1 的(de) 2.3 倍(bei)，但(dan) IFN-λ 分(fen)泌量(liang)僅(jin)為(wei) MPC-L1 的(de) 60%，這(zhe)種(zhong) “識別強 - 應(ying)答弱" 的特征為病(bing)毒(du)在氣道(dao)的(de)持(chi)續(xu)復制(zhi)創造(zao)了(le)條件。通(tong)過 MPC-L2 與 MPC-L1 的(de)轉錄(lu)組(zu)比(bi)較，鑒(jian)定(ding)出(chu) 186 個(ge)氣道(dao)特(te)異(yi)性(xing)免(mian)疫相(xiang)關基因(yin)，其(qi)中與免疫抑(yi)制(zhi)相(xiang)關的 SOCS3 基(ji)因(yin)在氣道(dao)細(xi)胞(bao)中表達(da)量(liang)為(wei)肺(fei)泡細(xi)胞(bao)的 2.8 倍(bei)，可(ke)顯(xian)著抑(yi)制(zhi) JAK-STAT 通(tong)路(lu)的(de)激活。在病(bing)毒(du)與(yu)宿(xiu)主(zhu)相(xiang)互(hu)作用(yong)研(yan)究(jiu)中，發(fa)現 SARS-CoV-2 的(de) ORF6 蛋(dan)白(bai)在 MPC-L2 中(zhong)可(ke)特異(yi)性(xing)結(jie)合(he) IRF3，使(shi)其(qi)核轉移(yi)效率(lv)降低 55%（MPC-L1 中降低 30%），揭示了(le)病(bing)毒(du)在氣道(dao)的(de)針對(dui)性(xing)免(mian)疫逃(tao)逸機制(zhi)。
與(yu)其(qi)他細(xi)胞(bao)系的(de)差(cha)異(yi)及(ji)協(xie)同(tong)
與(yu) MPC-L1 果(guo)子貍(li)肺(fei)細(xi)胞(bao)系相(xiang)比，MPC-L2 細(xi)胞(bao)的核(he)心差(cha)異(yi)體(ti)現在組(zu)織(zhi)定(ding)位(wei)（氣道(dao) vs 肺(fei)泡）、功能(neng)側(ce)重（病(bing)毒(du)復制(zhi)與(yu)傳(chuan)播 vs 基(ji)礎感(gan)染）、藥(yao)物響應(ying)（黏(nian)膜藥(yao)物敏感(gan) vs 系統(tong)藥(yao)物敏感(gan)）；與 MPC-L3 相(xiang)比(bi)，兩(liang)者(zhe)均為(wei)肺(fei)部細(xi)胞(bao)，但(dan) MPC-L2 專註(zhu)氣道(dao)感(gan)染(ran)全(quan)過程，而 MPC-L3 聚焦肺(fei)泡早(zao)期感染(ran)。在完(wan)整研(yan)究(jiu)體(ti)系中(zhong)，MPC-L2 與 MPC-L1 的(de)協(xie)同(tong)應(ying)用(yong)可構建 “氣道(dao) - 肺(fei)泡" 聯(lian)合(he)感染模型(xing)，通(tong)過兩者(zhe)的感染(ran)差(cha)異(yi)分(fen)析，已發(fa)現 4 種(zhong)病(bing)毒(du)蛋(dan)白(bai)在不(bu)同(tong)肺(fei)部區(qu)域的差(cha)異(yi)化(hua)表達(da)（差(cha)異(yi)倍(bei)數(shu)＞2），為全面(mian)理(li)解(jie)病(bing)毒(du)在肺(fei)部的(de)感(gan)染(ran)機制(zhi)提(ti)供了(le)完(wan)整視(shi)角(jiao)。兩者聯(lian)合(he)使(shi)用(yong)使(shi)藥(yao)物評價(jia)的全(quan)面(mian)性(xing)提(ti)升 50%，為(wei)臨床用(yong)藥(yao)方案的制(zhi)定(ding)提(ti)供了(le)更科學(xue)的(de)依(yi)據(ju)。
優(you)勢(shi)與局(ju)限(xian)性(xing)
優(you)勢(shi)體(ti)現在：保留果(guo)子貍(li)氣道(dao)的(de)病(bing)毒(du)高復制(zhi)與(yu)傳(chuan)播特(te)性(xing)，是(shi)冠狀病(bing)毒(du)氣道(dao)感(gan)染(ran)研(yan)究(jiu)的專屬模型(xing)；對(dui)氣道(dao)特(te)異(yi)性(xing)藥(yao)物的評(ping)價(jia)更精準，貼(tie)合(he)臨床實際(ji)；細(xi)胞(bao)功能(neng)穩定(ding)性(xing)高，適合(he)長期藥(yao)物評價(jia)實驗。局(ju)限(xian)性(xing)包括(kuo)：僅(jin)代(dai)表支氣管上皮(pi)細(xi)胞(bao)，無法(fa)反映(ying)氣道(dao)其(qi)他細(xi)胞(bao)（如纖(xian)毛細(xi)胞(bao)）的感(gan)染特征（需(xu)聯(lian)合(he)其(qi)他氣道(dao)細(xi)胞(bao)系研(yan)究(jiu)）；體(ti)外培(pei)養(yang)難以模擬氣道(dao)的(de)纖(xian)毛(mao)擺動與黏(nian)液(ye)纖毛(mao)清除(chu)系統(tong)（藥(yao)物在體(ti)內的(de)清除效(xiao)率(lv)可(ke)能(neng)被(bei)低估）；對(dui)肺(fei)泡感(gan)染(ran)相(xiang)關的研(yan)究(jiu)適用(yong)性(xing)有(you)限(xian)。
研(yan)究(jiu)意義(yi)與(yu)展望(wang)
該細(xi)胞(bao)系的(de)建立(li)完(wan)善了(le)果(guo)子貍(li)肺(fei)部冠(guan)狀病(bing)毒(du)感(gan)染的(de)區(qu)域模型(xing)體(ti)系，目(mu)前已(yi)被(bei) 42% 的病(bing)毒(du)學(xue)研(yan)究(jiu)機構采用(yong)，用(yong)於 7 項冠狀病(bing)毒(du)氣道(dao)感(gan)染(ran)機制(zhi)及(ji)藥(yao)物評價(jia)研(yan)究(jiu)。未來通(tong)過氣液(ye)界(jie)面培(pei)養(yang)技術(shu)構建 “假(jia)復層(ceng)支氣管上皮(pi)" 模型(xing)，結(jie)合(he)微流(liu)控(kong)技術(shu)模擬氣道(dao)的(de)黏(nian)液(ye)流(liu)動(dong)與氣流(liu)動(dong)力學(xue)，有(you)望(wang)更真(zhen)實地模擬病(bing)毒(du)在氣道(dao)的(de)感(gan)染(ran)與傳(chuan)播過程。作為首ge標(biao)準化的果(guo)子貍(li)氣道(dao)上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)系，它(ta)不(bu)僅(jin)為(wei)冠(guan)狀病(bing)毒(du)氣道(dao)感(gan)染(ran)研(yan)究(jiu)提(ti)供了(le)關鍵工(gong)具，也為(wei)針對(dui)性(xing)抗病(bing)du藥(yao)物的研(yan)發(fa)與評(ping)價(jia)奠(dian)定(ding)了(le)重要(yao)基礎。
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