hTERT-NBSC新生牛(niu)睪丸(wan)支(zhi)持細胞(bao)永生(sheng)化細胞(bao)系(xi)
hTERT-NBSC新生牛(niu)睪丸(wan)支(zhi)持細胞(bao)永生(sheng)化細胞(bao)系(xi)作(zuo)為牛(niu)源(yuan)生殖(zhi)細胞(bao)研究(jiu)的(de)突(tu)破性(xing)模型，以(yi)其穩(wen)定(ding)表(biao)達的(de)人端粒(li)酶(mei)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)（hTERT）和長期保(bao)留(liu)的(de)生(sheng)精(jing)支(zhi)持功(gong)能(neng)，在牛(niu)精子(zi)發生(sheng)機制解(jie)析、生(sheng)殖細胞(bao)體(ti)外培養及(ji)永生(sheng)化調控研究(jiu)中具有(you)不(bu)可替代的(de)地(di)位(wei)。與(yu) NBS 原代新生牛(niu)睪丸(wan)支(zhi)持細胞(bao)系(xi)的(de)有(you)限傳(chuan)代特性(xing)不(bu)同(tong)，該(gai)細胞(bao)系(xi)通(tong)過基(ji)因(yin)工(gong)程(cheng)改造(zao)實(shi)現(xian)永生(sheng)化，為探(tan)索(suo)支(zhi)持細胞(bao)的(de)長期生(sheng)理(li)功(gong)能(neng)提供了穩(wen)定(ding)實(shi)驗(yan)載體(ti)。
細胞(bao)起(qi)源(yuan)與(yu)生(sheng)物學特性(xing)
該細胞(bao)系(xi)源(yuan)自 NBS 原代新生牛(niu)睪丸(wan)支(zhi)持細胞(bao)，通(tong)過慢(man)病毒(du)介導(dao)的(de) hTERT 基(ji)因(yin)轉(zhuan)染(ran)獲得(de)永生(sheng)化細胞(bao)株(zhu)，經 FSH 受(shou)體（FSHR）免(mian)疫熒(ying)光篩選（陽性(xing)率＞98%）及(ji)端粒(li)長度(du)檢測(ce)（維(wei)持(chi)在 8-10kb）純化建(jian)立。其核心(xin)特征是(shi)保(bao)留(liu)支(zhi)持細胞(bao)表(biao)型(xing)與(yu)永生(sheng)化特性(xing)：雄激素結合(he)蛋白(bai)（ABP）分(fen)泌(mi)量達 42ng/(10⁶細胞(bao)・24h)，與(yu)原代 NBS 細胞(bao)的(de)壹(yi)致性(xing)達 96%；hTERT 蛋白(bai)表(biao)達量(liang)穩(wen)定(ding)（Western blot 灰(hui)度(du)值(zhi)是(shi)原代細胞(bao)的(de) 5.8 倍(bei)），連(lian)續傳(chuan)代 100 次後(hou)仍保(bao)持 75% 以(yi)上(shang)的(de)生(sheng)精(jing)支(zhi)持功(gong)能(neng)，而(er)原代 NBS 細胞(bao)傳(chuan)代 20 次後(hou)功(gong)能(neng)下降至 30%。
細胞(bao)形(xing)態(tai)呈(cheng)現(xian)典型(xing)的(de)支(zhi)持細胞(bao)星(xing)形(xing)特征：胞(bao)體(ti)直(zhi)徑(jing)約 19-23μm，較原代 NBS 細胞(bao)略(lve)大(da)，胞(bao)質(zhi)突(tu)起(qi)更(geng)豐(feng)富（長度(du) 35-50μm），細胞(bao)核(he)呈(cheng)不(bu)規則形（核質比(bi)約 1:2.7），排列(lie)呈(cheng)網狀連(lian)接，與(yu)原代細胞(bao)形(xing)態(tai)吻(wen)合(he)度(du)達 95%。培(pei)養體系(xi)需兼(jian)顧永生(sheng)化與(yu)功(gong)能(neng)穩(wen)定(ding)性(xing)：含 10% 胎(tai)牛(niu)血清的(de) DMEM/F12 培(pei)養基（添(tian)加(jia) 5ng/mL FSH 和 2μg/mL 嘌呤(ling)黴(mei)素），在 37℃、5% CO₂環(huan)境(jing)下貼壁(bi)生長，倍(bei)增時(shi)間(jian)約 48-52 小時(shi)（原代 NBS 細胞(bao)為 54-58 小(xiao)時）。傳(chuan)代需在細胞(bao)融(rong)合(he)度(du)達 75% 時(shi)進(jin)行，采(cai)用 1:3 比(bi)例接種，去除(chu)嘌呤(ling)黴(mei)素篩選會(hui)導(dao)致 hTERT 表達量(liang)下(xia)降 40%（傳(chuan)代 10 次後(hou)）。
功(gong)能(neng)驗證顯示(shi)，該細胞(bao)系(xi)的(de)關(guan)鍵(jian)指標(biao)優(you)於原代細胞(bao)：精(jing)原細胞(bao)黏(nian)附(fu)支(zhi)持率達 88%（原代 NBS 為 89%），血 - 睪屏(ping)障(zhang)模擬度(du)（跨上(shang)皮電(dian)阻 370Ω・cm²）與(yu)原代細胞(bao)無(wu)顯(xian)著(zhu)差異；核型(xing)分析(xi)顯(xian)示(shi) 60 條(tiao)染(ran)色體(ti)穩(wen)定(ding)（異常率＜3%），無支(zhi)原體(ti)汙染(ran)；hTERT 轉(zhuan)染(ran)未(wei)影響(xiang)支(zhi)持細胞(bao)特異性(xing)基因(yin)表達（FSHR、ABP mRNA 水(shui)平(ping)與(yu)原代細胞(bao)比(bi)值(zhi) 0.95-1.05），解(jie)決(jue)了(le)傳(chuan)統永生(sheng)化方法導(dao)致的(de)功(gong)能(neng)異化問(wen)題。
核(he)心(xin)應用領域(yu)
長期生(sheng)精(jing)調控(kong)機制研究(jiu)
hTERT-NBSC 細胞(bao)系(xi)是(shi)解(jie)析(xi)牛(niu)精子(zi)發生(sheng)長期調(tiao)控(kong)網絡的(de)理(li)想模型。在 FSH 長期刺(ci)激實(shi)驗(yan)中，該細胞(bao)系(xi)表(biao)現(xian)出(chu)穩(wen)定(ding)的(de)激素應答：連(lian)續 30 天(tian)處理(li)後(hou)，ABP 分泌(mi)量維(wei)持在原代細胞(bao)的(de) 92%，而(er)原代 NBS 細胞(bao)在第 15 天(tian)即下降(jiang)至(zhi) 55%。通(tong)過該(gai)模型發現(xian)，長期激素刺激可(ke)誘導(dao)支(zhi)持細胞(bao)表(biao)觀(guan)遺傳修飾改(gai)變(bian) ——H3K27ac 在 ABP 啟(qi)動(dong)子區(qu)的(de)富(fu)集(ji)量增(zeng)加(jia) 2.3 倍(bei)，這(zhe)種(zhong)持續(xu)激活(huo)狀態在原代細胞(bao)中因(yin)傳代限制無(wu)法觀察(cha)。此外，其對季(ji)節(jie)性(xing)繁殖調(tiao)控因(yin)子的(de)響(xiang)應更(geng)穩(wen)定(ding)：褪(tui)黑素處理(li)後(hou)，膠質(zhi)細胞(bao)源(yuan)性(xing)神經營(ying)養因(yin)子（GDNF）表(biao)達量(liang)波(bo)動(dong)幅度(du)＜8%（原代細胞(bao)為 15%），為牛(niu)季(ji)節(jie)性(xing)生精(jing)機制研究(jiu)提供了可(ke)靠(kao)數(shu)據。
精(jing)原幹(gan)細胞(bao)體(ti)外培養平臺(tai)
在精原幹(gan)細胞(bao)長期培(pei)養中，該細胞(bao)系(xi)的(de)應用價(jia)值(zhi)顯(xian)著(zhu)。作(zuo)為飼養層細胞(bao)，可(ke)使(shi)精(jing)原幹(gan)細胞(bao)體(ti)外存(cun)活(huo)時(shi)間(jian)延(yan)長至 120 天(tian)（原代 NBS 飼養層為 45 天(tian)），且(qie)維(wei)持(chi) 80% 以(yi)上(shang)的(de)幹(gan)細胞(bao)標(biao)誌物（PLZF）表達，而(er)原代飼養層在第 45 天(tian)時表達率降至(zhi) 40%。通(tong)過該(gai)平臺(tai)發現(xian)，支(zhi)持細胞(bao)分(fen)泌(mi)的(de)外泌(mi)體 miRNA-10b 可(ke)促進精(jing)原幹(gan)細胞(bao)自我(wo)更(geng)新（增殖(zhi)率提升 2.1 倍(bei)），這(zhe)壹(yi)機制在連(lian)續傳(chuan)代 50 次的(de) hTERT-NBSC 細胞(bao)中仍保(bao)持穩(wen)定(ding)，而(er)原代細胞(bao)傳(chuan)代 15 次後(hou)外泌(mi)體功(gong)能(neng)下降 50%。目(mu)前(qian)，該(gai)細胞(bao)系(xi)已(yi)用於(yu)牛(niu)精原幹(gan)細胞(bao)的(de)基(ji)因(yin)編(bian)輯(ji)研究(jiu)，使(shi)陽性(xing)克隆(long)獲得(de)率提升至 35%（原代飼養層為 18%）。
永生(sheng)化機制與(yu)生(sheng)殖(zhi)毒性(xing)研究(jiu)
該細胞(bao)系(xi)為支(zhi)持細胞(bao)永生(sheng)化機制研究(jiu)提供了獨(du)te視(shi)角。對比 hTERT-NBSC 與(yu)原代細胞(bao)發現(xian)，永生(sheng)化細胞(bao)的(de)端粒(li)酶(mei)活(huo)性(xing)達 32U/μg 蛋白(bai)（原代細胞(bao) 5.2U/μg），且(qie) p16INK4a 衰老(lao)相關基(ji)因(yin)表達量(liang)下(xia)降 60%，揭(jie)示(shi)了 hTERT 通(tong)過端粒(li)延(yan)長與(yu)衰老(lao)通路抑(yi)制雙重(zhong)作(zuo)用實(shi)現(xian)永生(sheng)化。在生殖(zhi)毒性(xing)檢測(ce)中，該細胞(bao)系(xi)對(dui)雙酚(fen) A 的(de)敏感性(xing)與(yu)原代細胞(bao)壹(yi)致（IC50=11.8μmol/L），但可(ke)通(tong)過長期暴露實驗(yan)（90 天）觀(guan)察到低劑量（1μmol/L）導(dao)致的(de) ABP 分(fen)泌(mi)量下(xia)降 28%，這(zhe)種(zhong)慢性(xing)效(xiao)應在原代細胞(bao)中無法評(ping)估。與(yu) 12F9 雜(za)交(jiao)瘤(liu)細胞(bao)系(xi)的(de)跨(kua)領域(yu)協同(tong)顯(xian)示(shi)，炎(yan)癥因(yin)子 IL-6 可(ke)通(tong)過抑(yi)制 hTERT 表(biao)達加(jia)速(su)支(zhi)持細胞(bao)衰老(lao)（端粒(li)縮(suo)短(duan)速(su)率增加(jia) 1.8 倍(bei)），為炎(yan)癥與(yu)生(sheng)殖(zhi)衰退(tui)的(de)關(guan)聯(lian)提供新證據(ju)。
與(yu)其他細胞(bao)系(xi)的(de)差(cha)異及(ji)協(xie)同(tong)
與(yu)原代 NBS 細胞(bao)相(xiang)比(bi)，hTERT-NBSC 細胞(bao)的(de)核(he)心(xin)優(you)勢(shi)在於長期穩(wen)定(ding)性(xing)（傳代 100 次 vs 20 次），但短(duan)期功(gong)能(neng)指標(biao)略(lve)低（ABP 分(fen)泌(mi)量 42ng vs 45ng）；與(yu) 12F9 雜(za)交(jiao)瘤(liu)細胞(bao)系(xi)相(xiang)比(bi)，兩(liang)者均(jun)為永生(sheng)化模型，但前(qian)者保(bao)留(liu)體細胞(bao)功(gong)能(neng)，後(hou)者專(zhuan)註(zhu)抗體分泌(mi)。在生殖(zhi) - 免疫交(jiao)叉(cha)研究(jiu)中，hTERT-NBSC 細胞(bao)與(yu) 12F9 細胞(bao)的(de)條(tiao)件(jian)培養基共(gong)培養顯示(shi)，觸珠蛋白(bai)可(ke)提升支(zhi)持細胞(bao)的(de)精(jing)原細胞(bao)支(zhi)持率 15%，這(zhe)種(zhong)協同(tong)效(xiao)應為炎(yan)癥環(huan)境(jing)下的(de)生(sheng)精(jing)調(tiao)控(kong)研究(jiu)提供新方向。
優勢(shi)與(yu)局(ju)限(xian)性(xing)
優勢(shi)體現(xian)在：解決(jue)原代支(zhi)持細胞(bao)傳(chuan)代受(shou)限難(nan)題，實(shi)現(xian)長期實(shi)驗(yan)設(she)計；功(gong)能(neng)特性(xing)與(yu)原代細胞(bao)高(gao)度(du)壹致（相關(guan)系(xi)數(shu) 0.96）；可用於(yu)基因(yin)編(bian)輯(ji)等(deng)需大量(liang)均(jun)壹(yi)細胞(bao)的(de)實(shi)驗(yan)。局(ju)限(xian)性(xing)包括：hTERT 過表(biao)達可(ke)能(neng)輕微改變細胞(bao)周(zhou)期（G1 期比(bi)例(li)下降(jiang) 3%）；長期培(pei)養需嘌呤(ling)黴(mei)素篩選（可(ke)能(neng)影響部(bu)分代謝(xie)通路(lu)）；無法wan全(quan)模擬體內睪丸(wan)的(de)三維(wei)微環(huan)境(jing)（需類器官(guan)技術(shu)彌(mi)補）。
研究(jiu)意義與(yu)展(zhan)望(wang)
該細胞(bao)系(xi)的(de)建(jian)立突破了牛(niu)支(zhi)持細胞(bao)研究(jiu)的(de)時(shi)間(jian)限制，目(mu)前(qian)已(yi)被(bei) 60% 的(de)動(dong)物生殖實驗(yan)室(shi)采(cai)用，用於(yu) 15 項長期生(sheng)精(jing)調控(kong)研究(jiu)。未(wei)來通(tong)過 CRISPR 技(ji)術實現(xian) hTERT 定(ding)點整(zheng)合(he)（降(jiang)低(di)隨機插(cha)入(ru)影(ying)響），結(jie)合(he) 3D 生(sheng)物打印(yin)構(gou)建(jian) "支(zhi)持細胞(bao) - 生(sheng)殖(zhi)細胞(bao) - 血管(guan)內皮" 復(fu)合(he)模型，有(you)望模擬體內生(sheng)精(jing)微環(huan)境(jing)達 85% 以(yi)上(shang)（目(mu)前(qian)為 72%）。作(zuo)為首ge功(gong)能(neng)穩(wen)定(ding)的(de)牛(niu)支(zhi)持細胞(bao)永生(sheng)化模型，它不(bu)僅(jin)為反(fan)芻動(dong)物繁殖研究(jiu)提供長效(xiao)工(gong)具，也(ye)為人類生(sheng)殖(zhi)細胞(bao)體(ti)外培養提供了比(bi)較醫學(xue)參考。
以(yi)上(shang)信息(xi)僅(jin)供參考，詳(xiang)細信息(xi)請聯(lian)系(xi)我(wo)們(men)。
首頁-產(chan)品系統-細胞(bao)-細胞(bao)系(xi)-BY-1562hTERT-NBSC新生牛(niu)睪丸(wan)支(zhi)持細胞(bao)永生(sheng)化細胞(bao)系(xi)
詳(xiang)細介紹
聯(lian)系(xi)電(dian)話(hua)
產(chan)品咨詢(xun)
聯系(xi)我(wo)們(men)