4F11奶(nai)牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白雜(za)交(jiao)瘤細胞(bao)系
4F11奶牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白雜(za)交(jiao)瘤細胞(bao)系作(zuo)為抗奶牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白單克隆(long)抗(kang)體制(zhi)備(bei)的核心(xin)模(mo)型(xing)，以其(qi)穩(wen)定(ding)的抗(kang)體分(fen)泌能力(li)和高(gao)度的抗(kang)原特(te)異(yi)性(xing)，在(zai)奶牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白功能解(jie)析、炎癥診(zhen)斷(duan)試劑(ji)研(yan)發(fa)及(ji)免疫(yi)調(tiao)控機(ji)制(zhi)研究中(zhong)具有不(bu)可(ke)替代的地(di)位(wei)。與環(huan)形泰勒(le)蟲(chong)裂殖(zhi)體感染(ran)的牛(niu)淋巴細胞(bao)的(de)病(bing)理(li)研究定(ding)位(wei)不(bu)同，該(gai)細胞(bao)系源(yuan)自(zi)雜(za)交(jiao)瘤技(ji)術(shu)構(gou)建的(de)永(yong)生化 B 淋(lin)巴(ba)細胞(bao)，為探(tan)索奶(nai)牛(niu)急性期(qi)蛋(dan)白的(de)免(mian)疫(yi)功能提供了標準化的(de)抗(kang)體(ti)生產載(zai)體(ti)。
細胞(bao)起(qi)源(yuan)與(yu)生物學(xue)特(te)性(xing)
該(gai)細胞(bao)系源(yuan)自(zi) Balb/c 小(xiao)鼠骨(gu)髓(sui)瘤(liu)細胞(bao)與(yu)免(mian)疫(yi)奶(nai)牛(niu)脾臟 B 淋巴(ba)細胞(bao)的(de)融(rong)合體，通過(guo)有(you)限(xian)稀(xi)釋法克隆(long)篩(shai)選(xuan)獲(huo)得，經間(jian)接 ELISA 驗(yan)證(zheng)抗(kang)觸(chu)珠(zhu)蛋(dan)白抗(kang)體(ti)效價(jia)達 1:128000 後純(chun)化建(jian)立(li)。其(qi)核心(xin)特(te)征(zheng)是(shi)高(gao)特(te)異(yi)性(xing)的(de)抗體分(fen)泌表型：抗(kang)觸(chu)珠(zhu)蛋(dan)白單克隆(long)抗(kang)體（IgG1 亞(ya)型(xing)）分(fen)泌量(liang)穩(wen)定(ding)在 35μg/(10⁶細胞(bao)・24h)，與(yu)奶(nai)牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白的(de)結(jie)合常數(shu)（Kd）達 2.3×10⁻⁹mol/L，交(jiao)叉(cha)反應(ying)率（與其(qi)他(ta)牛(niu)源(yuan)急(ji)性期(qi)蛋(dan)白）＜0.5%，抗(kang)體(ti)特(te)異(yi)性(xing)顯(xian)著(zhu)高於多克隆(long)抗(kang)血清(qing)（交(jiao)叉(cha)反應(ying)率 12%），與環形泰勒(le)蟲(chong)感染(ran)淋巴(ba)細胞(bao)的(de)病(bing)理(li)特(te)性(xing)形成(cheng)鮮(xian)明對比(bi)。
細胞(bao)形態呈現典型的(de)雜交(jiao)瘤細胞(bao)特(te)征(zheng)：胞(bao)體(ti)直(zhi)徑(jing)約(yue) 14-16μm，較(jiao)環形泰勒(le)蟲(chong)感染(ran)的淋(lin)巴(ba)細胞(bao)略(lve)小(xiao)，細胞(bao)核呈圓(yuan)形或(huo)橢(tuo)圓(yuan)形（核質(zhi)比(bi)約(yue) 1:2.5），胞(bao)質(zhi)豐(feng)富(fu)且含有大(da)量粗面(mian)內質(zhi)網(wang)（電鏡觀察(cha)），排(pai)列(lie)呈松散懸浮(fu)狀(zhuang)態，與雜(za)交(jiao)瘤細胞(bao)的(de)永(yong)生化增(zeng)殖(zhi)特(te)性(xing)吻(wen)合度達 97%。培養體系需優化抗(kang)體(ti)分(fen)泌環(huan)境(jing)：含 15% 胎牛(niu)血清(qing)的(de) DMEM 高糖(tang)培養基(ji)（添(tian)加(jia) 1% 次(ci)黃piao呤 - 氨(an)基(ji)蝶(die)呤 - 胸(xiong)腺嘧啶(ding)核苷(gan)選(xuan)擇(ze)液(ye)），在(zai) 37℃、5% CO₂環境下懸浮(fu)生(sheng)長，倍增(zeng)時間約(yue) 30-34 小(xiao)時（短(duan)於環形泰勒(le)蟲(chong)感染(ran)的淋(lin)巴(ba)細胞(bao)）。傳(chuan)代需在(zai)細胞(bao)密度(du)達 2×10⁶個 /mL 時(shi)進行(xing)，按(an) 1:5 比(bi)例(li)稀(xi)釋接種(zhong)，血清(qing)濃度過(guo)低(di)（＜10%）會導致(zhi)抗(kang)體分(fen)泌量(liang)下降 40%（從(cong) 35μg 降(jiang)至 21μg）。
功能驗(yan)證(zheng)顯(xian)示(shi)，該(gai)細胞(bao)系保(bao)留關鍵(jian)抗(kang)體分(fen)泌功能：連續(xu)傳(chuan)代 60 次(ci)後，抗(kang)體效價(jia)仍(reng)維(wei)持在 1:100000 以上，抗(kang)體(ti)可(ke)變(bian)區基(ji)因序(xu)列(lie)無(wu)突變(bian)（測(ce)序驗(yan)證(zheng)）；無(wu)支(zhi)原體及病(bing)毒(du)汙(wu)染(ran)，核型(xing)分(fen)析顯(xian)示(shi)染(ran)色體數(shu)目約(yue) 90-100 條(tiao)（符合骨(gu)髓(sui)瘤(liu) - 淋(lin)巴(ba)細胞(bao)融(rong)合體特(te)征(zheng)），比(bi)環(huan)形泰勒(le)蟲(chong)感染(ran)淋巴(ba)細胞(bao)的(de)核型(xing)穩(wen)定(ding)性更(geng)高（染(ran)色體異常率＜5% vs 45%）；抗體(ti)與奶(nai)牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白的(de)抗(kang)原表位(wei)結合位(wei)點位(wei)於其(qi) β 鏈(lian)的(de)第(di) 58-72 位(wei)氨(an)基(ji)酸（肽段(duan)競(jing)爭(zheng)實驗(yan)證(zheng)實(shi)），這壹(yi)特(te)異(yi)性(xing)在(zai)不(bu)同品種奶(nai)牛(niu)（荷斯坦、娟(juan)姍）中(zhong)均(jun)保(bao)持壹(yi)致(zhi)（結(jie)合率＞95%）。
核心(xin)應(ying)用(yong)領(ling)域(yu)
奶(nai)牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白功能研究
4F11 細胞(bao)系是解(jie)析奶牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白免(mian)疫(yi)功能的理想工具。在炎(yan)癥應(ying)答研究中(zhong)，該(gai)細胞(bao)系分(fen)泌的(de)抗(kang)體(ti)表現出(chu)精(jing)準的抗(kang)原識(shi)別(bie)能力(li)：通過(guo)免(mian)疫(yi)共沈(chen)澱實(shi)驗(yan)證(zheng)實(shi)，奶(nai)牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白可(ke)與(yu)脂多糖(tang)（LPS）形成(cheng)復合物（結(jie)合率 82%），而(er)環(huan)形泰勒(le)蟲(chong)感染(ran)的淋(lin)巴(ba)細胞(bao)因(yin)缺(que)乏特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體，無法實現此類分(fen)子(zi)互(hu)作(zuo)分(fen)析。利(li)用(yong)該(gai)抗體(ti)建立(li)的免疫(yi)熒光(guang)定(ding)位(wei)技術(shu)顯(xian)示(shi)，觸珠(zhu)蛋(dan)白在(zai)奶(nai)牛(niu)肝(gan)臟細胞(bao)的(de)分(fen)泌泡(pao)中(zhong)富(fu)集（熒光(guang)強度是(shi)胞(bao)質(zhi)的(de) 5.3 倍(bei)），且(qie)在(zai)大腸桿菌(jun)感(gan)染(ran)後 4 小(xiao)時(shi)出(chu)現顯(xian)著(zhu)的胞(bao)外(wai)釋放(fang)（分(fen)泌量(liang)增(zeng)加(jia) 3.8 倍），為觸珠(zhu)蛋(dan)白的(de)急(ji)性(xing)期(qi)響應機(ji)制(zhi)提供了直接可(ke)視(shi)化證(zheng)據(ju)。此(ci)外(wai)，通(tong)過(guo)抗(kang)體阻斷實(shi)驗(yan)發(fa)現，觸珠(zhu)蛋(dan)白可(ke)抑制(zhi)中(zhong)性粒(li)細胞(bao)的(de)過(guo)度(du)激活（活性氧(yang)釋放(fang)量下降 45%），揭示(shi)其(qi)在(zai)炎(yan)癥消(xiao)退(tui)中(zhong)的調(tiao)節作(zuo)用(yong)。
炎癥診(zhen)斷(duan)試劑(ji)研(yan)發(fa)
在(zai)奶牛(niu)炎癥疾(ji)病診(zhen)斷(duan)中(zhong)，該(gai)細胞(bao)系的應(ying)用(yong)價(jia)值(zhi)尤(you)為突出(chu)。基(ji)於 4F11 抗體開發(fa)的(de) ELISA 檢(jian)測(ce)試劑盒，對奶(nai)牛(niu)血清(qing)觸(chu)珠(zhu)蛋(dan)白的(de)檢(jian)測(ce)靈敏(min)度(du)達 0.1ng/mL，是傳(chuan)統(tong)檢測(ce)方法的 8 倍(bei)，且與(yu)臨床炎癥評分(fen)的(de)相(xiang)關性(xing)達 0.93（環形泰勒(le)蟲(chong)感染(ran)牛(niu)的檢測(ce)符合率 91%）。對比(bi)試(shi)驗(yan)顯(xian)示(shi)，該(gai)試劑(ji)盒對產後子宮(gong)炎(yan)奶牛(niu)的檢出(chu)率達 96%，顯(xian)著(zhu)高於常規白細胞(bao)計數(shu)法（78%），且檢(jian)測(ce)時間縮(suo)短至 1.5 小(xiao)時(shi)（傳統(tong)方法需 4 小(xiao)時）。在(zai)現場快速(su)檢測(ce)試紙條研發中(zhong)，該(gai)抗體(ti)的膠(jiao)體金(jin)標記物可(ke)實現觸珠(zhu)蛋(dan)白的(de)定(ding)性檢(jian)測(ce)（檢出(chu)限(xian) 5ng/mL），與實(shi)驗(yan)室 ELISA 結果的(de)壹(yi)致(zhi)性(xing)達 92%，目前(qian)已用(yong)於規模(mo)化奶(nai)牛(niu)場的乳腺炎(yan)早(zao)期(qi)篩查，使(shi)發病(bing)率(lv)預警(jing)準確率(lv)提升(sheng) 40%。
免(mian)疫(yi)調(tiao)控機(ji)制(zhi)研究
該(gai)細胞(bao)系分(fen)泌的(de)單克隆(long)抗(kang)體為觸珠(zhu)蛋(dan)白介(jie)導(dao)的(de)免疫(yi)調(tiao)控研(yan)究提供(gong)了特(te)異(yi)性(xing)工(gong)具。在 "觸(chu)珠(zhu)蛋(dan)白 - 巨(ju)噬(shi)細胞(bao)" 互(hu)作(zuo)實(shi)驗(yan)中(zhong)，4F11 抗體(ti)可特(te)異(yi)性(xing)阻斷觸(chu)珠(zhu)蛋(dan)白與(yu)巨(ju)噬(shi)細胞(bao)表面(mian) CD163 受體的(de)結(jie)合（阻斷率(lv) 90%），進而(er)抑制(zhi)細胞(bao)對血紅(hong)蛋(dan)白 - 血紅(hong)素復合物的(de)吞噬(shi)（吞噬率下降 68%），這壹(yi)發現為觸珠(zhu)蛋(dan)白清(qing)除(chu)循環血紅(hong)蛋(dan)白的(de)分(fen)子(zi)機(ji)制(zhi)提供了關鍵(jian)證(zheng)據。與(yu)環形泰勒(le)蟲(chong)感染(ran)模(mo)型(xing)的(de)協(xie)同研究顯(xian)示(shi)，觸珠(zhu)蛋(dan)白可(ke)結(jie)合蟲體釋放(fang)的血紅(hong)素（結(jie)合量達 12μg/mg 蛋(dan)白），降(jiang)低(di)其(qi)對宿主細胞(bao)的(de)氧(yang)化損傷（脂質(zhi)過(guo)氧(yang)化水(shui)平(ping)下降 52%），揭示(shi)了宿主對抗(kang)胞(bao)內(nei)寄(ji)生(sheng)蟲的新(xin)防(fang)禦路徑。
與(yu)其(qi)他(ta)細胞(bao)系的差(cha)異及(ji)協(xie)同
除與環形泰勒(le)蟲(chong)感染(ran)的淋(lin)巴(ba)細胞(bao)差(cha)異(yi)顯(xian)著(zhu)外(wai)，與(yu)其(qi)他(ta)抗(kang)牛(niu)蛋(dan)白雜(za)交(jiao)瘤細胞(bao)系相(xiang)比(bi)，4F11 細胞(bao)的(de)抗(kang)體(ti)分(fen)泌量(liang)更(geng)高(gao)（35μg vs 22μg），且對觸(chu)珠(zhu)蛋(dan)白的(de)親和力(li)強 3 倍(bei)（Kd 值低 1.8 倍(bei)）。在(zai)奶(nai)牛(niu)急性期(qi)反應研(yan)究中(zhong)，該(gai)細胞(bao)系的抗(kang)體與(yu)牛(niu)血清(qing)澱(dian)粉樣蛋(dan)白 A（SAA）雜(za)交(jiao)瘤細胞(bao)的(de)抗(kang)體(ti)可協(xie)同構建 "多重(zhong)炎癥因(yin)子(zi)檢測(ce)體系"，實現 6 種急性期(qi)蛋(dan)白的(de)同步定(ding)量（相(xiang)關系數(shu) 0.88），檢測(ce)效率提升(sheng) 5 倍(bei)。兩者(zhe)聯(lian)合應用(yong)可全(quan)面(mian)評估奶牛(niu)的炎癥狀(zhuang)態，為系統(tong)性免(mian)疫(yi)研(yan)究提供(gong)完整工具包(bao)。
優勢(shi)與(yu)局限(xian)性
優勢(shi)體(ti)現在：抗體分(fen)泌穩(wen)定(ding)且特(te)異(yi)性(xing)高(gao)，是觸珠(zhu)蛋(dan)白研(yan)究的金(jin)標準試劑(ji)來源(yuan)；基(ji)於該(gai)細胞(bao)系的診(zhen)斷(duan)試劑(ji)靈(ling)敏(min)度(du)與準確率(lv)優異(yi)，顯(xian)著(zhu)提升(sheng)奶(nai)牛(niu)炎癥檢(jian)測(ce)水平(ping)；永(yong)生化特(te)性(xing)確(que)保(bao)長期(qi)穩定(ding)供應(ying)（＞60 代），批次(ci)間差(cha)異率＜3%。局限(xian)性包(bao)括：僅分(fen)泌單壹(yi)亞(ya)型(xing)抗(kang)體(ti)（IgG1），無法覆(fu)蓋觸珠(zhu)蛋(dan)白的(de)所(suo)有(you)抗原表位(wei)（需多(duo)克隆(long)抗(kang)體補充）；懸(xuan)浮(fu)培養的放(fang)大生(sheng)產難(nan)度(du)高(gao)於貼(tie)壁細胞(bao)（生(sheng)物反(fan)應器(qi)產率 70% vs 貼(tie)壁 90%）；對非奶牛(niu)屬動物的(de)觸珠(zhu)蛋(dan)白識(shi)別(bie)率(lv)低（與(yu)水(shui)牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白結(jie)合率僅 32%）。
研究意(yi)義與展望
該(gai)細胞(bao)系的建(jian)立推(tui)動了(le)奶牛(niu)觸珠(zhu)蛋(dan)白研(yan)究從(cong)蛋(dan)白水(shui)平(ping)深(shen)入到功能機(ji)制(zhi)層面(mian)，目前(qian)已被(bei) 70% 的(de)奶牛(niu)疾(ji)病研(yan)究實驗(yan)室采用(yong)，用(yong)於 12 項炎癥相(xiang)關研(yan)究及 5 種(zhong)診(zhen)斷(duan)試劑(ji)的(de)開(kai)發(fa)。未來通過(guo)基(ji)因工(gong)程(cheng)改(gai)造（如(ru)敲(qiao)除(chu)抗(kang)體恒(heng)定(ding)區）構(gou)建人 - 牛(niu)嵌(qian)合抗體細胞(bao)系，結合無血清(qing)懸(xuan)浮(fu)培養技術(shu)（目(mu)前(qian)血清(qing)依(yi)賴(lai)率(lv) 80%），有(you)望(wang)進壹(yi)步提升(sheng)抗(kang)體產量與應(ying)用(yong)範圍(wei)。作(zuo)為奶牛(niu)免疫(yi)研(yan)究的特(te)色工具，它不(bu)僅(jin)為反芻(chu)動物急(ji)性期(qi)反應提(ti)供(gong)了(le)關鍵(jian)試(shi)劑，也(ye)為其(qi)他(ta)家(jia)畜(chu)的(de)炎(yan)癥診(zhen)斷(duan)技術(shu)開(kai)發提(ti)供(gong)了重(zhong)要參(can)考。
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