LⅡ小鼠網織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)瘤(liu)株細胞系
LⅡ小鼠網織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)瘤(liu)株細胞系源(yuan)自(zi) 615 近(jin)交(jiao)系小鼠的自(zi)發性網織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)，是(shi)保(bao)留(liu)網織(zhi)細(xi)胞惡(e)性轉化特征和淋巴造(zao)血(xue)組織(zhi)浸(jin)潤能力的惡(e)性腫(zhong)瘤(liu)模(mo)型，在(zai)網織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)的發病機(ji)制(zhi)、免(mian)疫(yi)逃(tao)逸及抗腫(zhong)瘤(liu)藥物篩(shai)選(xuan)研(yan)究中(zhong)具有重(zhong)要價(jia)值(zhi)，為解(jie)析(xi)這種(zhong)淋巴造(zao)血(xue)系統惡(e)性腫(zhong)瘤(liu)的生物學行(xing)為提供(gong)了(le)理(li)想工具(ju)。
該細胞系呈現典型的網(wang)織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)細胞形態與(yu)表(biao)型特征。顯微(wei)鏡下(xia)，細胞呈圓形或不(bu)規(gui)則形(xing)，以(yi)懸(xuan)浮(fu)生長(chang)為(wei)主(zhu)，部(bu)分細胞呈松散(san)聚集(ji)狀態，細胞體積(ji)較(jiao)大（直(zhi)徑 15-25μm），核(he)質(zhi)比ji高(gao)，細(xi)胞核(he)呈(cheng)圓形或腎形(xing)，染(ran)色(se)質(zhi)呈疏松網狀，可見 1-3 個明(ming)顯核(he)仁(ren)，核(he)分裂象(xiang)極為(wei)活躍(yue)（每 10 個高(gao)倍(bei)視野(ye) 15-20 個），胞質豐富(fu)，呈嗜堿(jian)性(xing)，可(ke)見(jian)偽足(zu)樣突起(qi)，電鏡下(xia)可見(jian)胞質內含(han)有豐富(fu)的核(he)糖(tang)體和少量(liang)粗(cu)面(mian)內質(zhi)網(wang)，細胞表(biao)面(mian)有較(jiao)多微(wei)絨(rong)毛(mao)，符(fu)合(he)網(wang)織(zhi)細(xi)胞的超(chao)微(wei)結(jie)構特點(dian)。免(mian)疫(yi)表(biao)型分析顯示，細胞高(gao)表(biao)達網(wang)織(zhi)細(xi)胞相關標誌(zhi)物 CD11b 和 Mac-1，流式(shi)細胞術(shu)檢(jian)測陽(yang)性(xing)率(lv)分別達 90% 和 85%，同時(shi)表(biao)達單核(he)巨(ju)噬細胞相關抗原 F4/80，陽(yang)性(xing)率(lv)達 75%，而 T、B 淋巴細(xi)胞標誌(zhi)物 CD3、CD19 呈陰性，證實其網(wang)織(zhi)細(xi)胞來源(yuan)特性(xing)。
體(ti)外培(pei)養(yang)體(ti)系中，LⅡ 細胞展(zhan)現(xian)出旺(wang)盛的增(zeng)殖(zhi)能力與強侵襲潛(qian)能。最適培(pei)養(yang)條(tiao)件為(wei)含(han) 15% 胎牛(niu)血(xue)清(qing)的 RPMI 1640 培(pei)養(yang)基(ji)，添加(jia) 2mM 谷(gu)an酰(xian)胺，在(zai) 37℃、5% CO₂環(huan)境下，傳代周(zhou)期(qi)約(yue) 48 小時(shi)，對(dui)數生長(chang)期(qi)細(xi)胞活力達(da) 95% 以(yi)上(shang)，倍(bei)增(zeng)時(shi)間(jian)約(yue) 24 小時(shi)，顯著(zhu)快(kuai)於正(zheng)常網織(zhi)細(xi)胞。其顯著(zhu)特點(dian)是(shi)體(ti)外侵襲(xi)能力ji強，Transwell 侵襲實驗中(zhong) 24 小時(shi)穿透(tou)基(ji)質膠(jiao)的細(xi)胞數是(shi)正(zheng)常(chang)網織(zhi)細(xi)胞的 8 倍(bei)，這種(zhong)侵襲(xi)能力與其高(gao)表(biao)達基(ji)質金屬(shu)蛋白酶 - 12（MMP-12）密切相關(guan)，酶譜(pu)分析顯示其活性較(jiao)正常(chang)網織(zhi)細(xi)胞高(gao) 6 倍(bei)，可高(gao)效(xiao)降解淋巴組織(zhi)的基(ji)質成(cheng)分。軟瓊脂(zhi)克隆(long)形(xing)成(cheng)率(lv)達 40%，克隆形態呈圓形或不(bu)規(gui)則形(xing)，邊(bian)緣(yuan)模(mo)糊，反映(ying)其高(gao)度惡(e)性的克(ke)隆形(xing)成(cheng)能力。凍存復蘇(su)性能優(you)異，液氮凍存後復蘇(su)存活率(lv)超 90%，連續傳代 50 次後(hou)，CD11b 表(biao)達及侵(qin)襲(xi)能力無明(ming)顯衰減(jian)，保(bao)證實驗的穩定性與(yu)可重(zhong)復性。
LⅡ 細胞的核(he)心(xin)價(jia)值體現在(zai)其對(dui)網(wang)織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)浸潤淋巴造(zao)血(xue)組織(zhi)過(guo)程的精(jing)準模(mo)擬(ni)。在(zai)動物模(mo)型中，將(jiang) 1×10⁶個細胞尾靜脈(mai)註射(she) 615 小鼠，7 天即(ji)可(ke)在(zai)脾(pi)臟和(he)淋巴結(jie)中檢(jian)測到(dao)腫(zhong)瘤(liu)細胞，14 天脾(pi)臟和(he)淋巴結(jie)明(ming)顯腫(zhong)大（重(zhong)量(liang)分別增加(jia) 4 倍和(he) 3 倍(bei)），21 天骨(gu)髓(sui)浸潤(run)率(lv)達 100%，病理切片顯示脾(pi)臟紅(hong)髓(sui)和白(bai)髓(sui)結(jie)構被(bei)腫(zhong)瘤(liu)細胞破壞(huai)，淋巴結(jie)濾(lv)泡(pao)消失，骨(gu)髓(sui)造血(xue)組織(zhi)被(bei)大量(liang)腫(zhong)瘤(liu)細胞取代，與(yu)人類(lei)網(wang)織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)的淋巴造(zao)血(xue)組織(zhi)浸(jin)潤模(mo)式(shi)高(gao)度壹致(zhi)。通(tong)過熒(ying)光標記(ji)追(zhui)蹤發現，腫(zhong)瘤(liu)細胞首先(xian)定植於(yu)脾(pi)臟紅(hong)髓(sui)血(xue)竇(dou)和(he)淋巴結(jie)邊(bian)緣(yuan)竇(dou)，通(tong)過高(gao)表(biao)達 L - 選(xuan)擇(ze)素(su)與(yu)淋巴組織(zhi)血(xue)管(guan)內皮(pi)細(xi)胞結(jie)合(he)，進(jin)而(er)浸(jin)潤(run)淋巴實質(zhi)，這種(zhong)浸潤(run)路徑依賴 CCR5-CCL5 趨化軸，CCR5 拮(jie)抗劑(ji)處(chu)理(li)可使(shi)脾(pi)臟和(he)淋巴結(jie)浸潤(run)率(lv)下降 60%。
在(zai)發病機(ji)制(zhi)研(yan)究中(zhong)，該細胞系揭示了(le)網(wang)織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)te有的分子異常(chang)。基(ji)因測序顯示，細胞存在(zai) NRAS 基(ji)因第 61 密碼子突變(bian)，導(dao)致(zhi) RAS/RAF/MEK 通路持續(xu)激活，Western blot 檢(jian)測顯示磷(lin)酸化 MEK（p-MEK）和(he)磷(lin)酸化 ERK（p-ERK）表(biao)達量(liang)較(jiao)正常(chang)網織(zhi)細(xi)胞高(gao) 8 倍(bei)和 10 倍(bei)，使(shi)用(yong) MEK 抑制(zhi)劑(ji)處(chu)理(li)後，細胞增殖(zhi)率(lv)下降 65%，雕(diao)亡(wang)率(lv)上(shang)升(sheng) 40%，證(zheng)實 NRAS 突變(bian)是(shi)其惡(e)性增殖(zhi)的重(zhong)要驅動因素。此(ci)外，細胞中 NF-κB 信(xin)號通(tong)路(lu)異常(chang)激活，p65 亞基(ji)核(he)轉位(wei)增(zeng)加(jia)，可結(jie)合(he)至(zhi) IL-6 啟(qi)動子區域(yu)，促進(jin)細(xi)胞因子分泌，NF-κB 抑(yi)制(zhi)劑(ji)處(chu)理(li)可使(shi)細(xi)胞 G1 期比例(li)增加(jia) 35%。
在(zai)轉移機(ji)制(zhi)研(yan)究中(zhong)，LⅡ 細胞展(zhan)現(xian)出廣泛的淋巴造(zao)血(xue)組織(zhi)轉移特性(xing)。動(dong)物實驗顯示，除脾(pi)臟、淋巴結(jie)和骨(gu)髓(sui)外，肝(gan)臟和(he)肺(fei)臟也(ye)可(ke)出現轉移竈(zao)，30 天肝(gan)轉移率(lv)達 50%，肺轉移率(lv)達 35%，這種(zhong)多器(qi)官(guan)轉移特性(xing)與(yu)細(xi)胞高(gao)表(biao)達黏(nian)附分子 CD44v6 相關(guan)，該分子可與(yu)多(duo)種(zhong)組織(zhi)中(zhong)的透(tou)明(ming)質酸結(jie)合(he)，流(liu)式(shi)細胞術(shu)檢(jian)測顯示其與(yu)肝(gan)竇(dou)內皮(pi)細(xi)胞的黏(nian)附率(lv)達 45%，CD44v6 抗體(ti)處(chu)理(li)可使(shi)肝(gan)轉移率(lv)下降 55%。體外遷移實驗顯示，細胞對不(bu)同組織(zhi)來(lai)源(yuan)的趨(qu)化因子均有較(jiao)強反應(ying)，遷移能力是(shi)其他(ta)肉(rou)瘤(liu)細胞系的 2 倍(bei)，這種(zhong)廣泛遷(qian)移能力與其高(gao)表(biao)達多(duo)種(zhong)趨化因子受體(ti)相(xiang)關。
在(zai)藥物篩(shai)選(xuan)應用(yong)中，LⅡ 細(xi)胞是(shi)評(ping)估(gu)網(wang)織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)治療藥物的有效(xiao)工具(ju)。體(ti)外藥敏(min)實驗顯示，細胞對蒽環(huan)類藥物敏感，阿mei素(su)的 IC50 約(yue) 0.2μM，藥物處(chu)理(li)後細胞周(zhou)期(qi)停滯(zhi)於 G2/M 期，雕(diao)亡(wang)相(xiang)關(guan)蛋白 Caspase-3 活性上(shang)調(tiao) 5 倍(bei)。聯(lian)合(he)用(yong)藥實驗證(zheng)實，阿(e)mei素與(yu) MEK 抑(yi)制(zhi)劑(ji)聯用(yong)可使(shi)殺傷率(lv)提升至 85%，較(jiao)單藥治療提高(gao) 35%，且(qie)對正(zheng)常(chang)網(wang)織(zhi)細(xi)胞毒(du)性(xing)更(geng)低(di)（IC50 提(ti)高(gao) 2.5 倍(bei)）。體內實驗中(zhong)，阿mei素腹(fu)腔註(zhu)射(she)可(ke)使(shi) 615 小鼠脾(pi)臟重(zhong)量(liang)減少 60%，外周(zhou)血(xue)腫(zhong)瘤(liu)細胞比例(li)從(cong) 60% 降至 20%，證(zheng)實其體(ti)內抗網(wang)織(zhi)細(xi)胞肉瘤(liu)活性。
在(zai)免(mian)疫(yi)逃(tao)逸機(ji)制(zhi)研(yan)究中(zhong)，LⅡ 細胞通過多(duo)種(zhong)方(fang)式(shi)逃避(bi)宿主(zhu)免(mian)疫(yi)攻擊。細(xi)胞表(biao)面(mian)高(gao)表(biao)達 PD-L1，較(jiao)正常(chang)網織(zhi)細(xi)胞高(gao) 5 倍(bei)，可與(yu) T 細(xi)胞表(biao)面(mian) PD-1 結(jie)合(he)抑(yi)制(zhi)免(mian)疫(yi)應(ying)答，PD-L1 抗體(ti)處(chu)理(li)可使(shi)腫(zhong)瘤(liu)細胞對細胞毒(du)性(xing) T 細胞的敏(min)感性(xing)提高(gao) 40%。同時(shi)，細(xi)胞分泌大(da)量(liang) IL-10，可誘(you)導(dao)調(tiao)節性 T 細胞（Treg）分化，使(shi)腫(zhong)瘤(liu)微(wei)環(huan)境中 Treg 比例(li)增加(jia) 3 倍，IL-10 中(zhong)和(he)抗體(ti)可增(zeng)強免(mian)疫(yi)細(xi)胞對腫(zhong)瘤(liu)細胞的殺傷活性。
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