U14小鼠(shu)子宮頸(jing)癌(ai)瘤株(zhu)細胞(bao)系(xi)
U14小鼠(shu)子宮頸(jing)癌(ai)瘤株(zhu)細胞(bao)系(xi)源(yuan)自 615 近(jin)交系(xi)小鼠(shu)的(de)自發性子宮頸(jing)癌(ai)組(zu)織(zhi)，是保(bao)留宮(gong)頸(jing)鱗狀(zhuang)上(shang)皮惡(e)性轉(zhuan)化特(te)征(zheng)和宮頸(jing)間(jian)質浸潤能(neng)力的(de)經(jing)典(dian)腫(zhong)瘤模(mo)型(xing)，在宮頸(jing)癌(ai)發生發展(zhan)機制(zhi)、宮(gong)頸(jing)組(zu)織(zhi)特(te)異性(xing)侵襲及抗(kang)腫瘤藥物篩選研(yan)究(jiu)中具有重要價(jia)值，為(wei)解析宮(gong)頸(jing)鱗癌(ai)的(de)生物學行為(wei)提供了(le)理(li)想工(gong)具。
該細(xi)胞(bao)系(xi)呈現(xian)典(dian)型(xing)的(de)宮(gong)頸(jing)癌(ai)細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai)與(yu)表(biao)型(xing)特(te)征(zheng)。顯(xian)微鏡下(xia)，細(xi)胞(bao)呈(cheng)多(duo)邊(bian)形(xing)或梭形(xing)，貼壁(bi)生長時排列(lie)呈不(bu)規(gui)則片(pian)狀或巢狀(zhuang)，部(bu)分區域可(ke)見(jian)角化珠樣(yang)結(jie)構(gou)，模擬(ni)宮(gong)頸(jing)鱗狀(zhuang)上(shang)皮的(de)分(fen)化特(te)征(zheng)。細胞(bao)核(he)呈(cheng)圓形或不(bu)規(gui)則形(xing)，核(he)質比高，染色(se)質呈粗顆(ke)粒狀，可(ke)見(jian) 2-3 個(ge)明顯(xian)核(he)仁(ren)，核(he)分(fen)裂(lie)象(xiang)多(duo)見(jian)（每(mei) 10 個(ge)高(gao)倍視野(ye) 8-10 個(ge)），胞(bao)質較少，呈嗜堿性(xing)，部(bu)分細(xi)胞(bao)胞(bao)質內可(ke)見(jian)角質顆粒，電鏡下(xia)可(ke)見(jian)細胞(bao)間(jian)橋(qiao)粒連接(jie)減(jian)少，張(zhang)力原(yuan)纖(xian)維排(pai)列紊亂，符合(he)鱗(lin)狀(zhuang)上(shang)皮(pi)源(yuan)性(xing)腫(zhong)瘤的(de)超(chao)微結(jie)構(gou)特(te)點。免疫表(biao)型(xing)分析(xi)顯(xian)示，細(xi)胞(bao)高(gao)表(biao)達(da)宮頸(jing)鱗狀(zhuang)上(shang)皮特(te)異性(xing)標誌物細胞(bao)角蛋白 17（CK17）和 p16INK4a，流(liu)式細胞(bao)術(shu)檢(jian)測(ce)陽(yang)性(xing)率分別(bie)達(da) 92% 和 88%，同時表(biao)達(da)宮頸(jing)癌(ai)相(xiang)關抗原(yuan) SCC-Ag，陽(yang)性(xing)率達(da) 80%，而腺(xian)上(shang)皮(pi)標誌物 CK7 表(biao)達(da)陰性，證實(shi)其(qi)宮頸(jing)鱗狀(zhuang)上(shang)皮來(lai)源(yuan)特(te)性。
體(ti)外(wai)培(pei)養(yang)體(ti)系(xi)中，U14 細胞(bao)展(zhan)現(xian)出穩(wen)定的(de)增(zeng)殖能力與(yu)強(qiang)侵襲潛能(neng)。最(zui)適(shi)培(pei)養(yang)條(tiao)件為(wei)含(han) 10% 胎牛(niu)血(xue)清的(de) RPMI 1640 培(pei)養(yang)基，添加(jia) 1% 谷(gu)an酰(xian)胺，在(zai) 37℃、5% CO₂環(huan)境(jing)下(xia)，傳(chuan)代周(zhou)期(qi)約 60 小時，對(dui)數(shu)生長期(qi)細胞(bao)活力達(da) 90% 以上，倍增(zeng)時間(jian)約 40 小時。其(qi)顯(xian)著特(te)點是(shi)對(dui)宮(gong)頸(jing)間(jian)質的(de)侵(qin)襲(xi)能(neng)力突出，Transwell 侵(qin)襲(xi)實(shi)驗(yan)中，以鼠(shu)宮頸(jing)間(jian)質基質為(wei)屏(ping)障時，24 小時穿透(tou)細胞(bao)數(shu)是乳(ru)腺(xian)癌(ai)細(xi)胞(bao)系(xi) MCF-7 的(de) 1.6 倍(bei)，這(zhe)種(zhong)組(zu)織(zhi)特(te)異性(xing)侵襲與(yu)細胞(bao)高(gao)表(biao)達(da)基質金(jin)屬蛋白(bai)酶 - 9（MMP-9）密切相關，酶譜分(fen)析顯(xian)示其(qi)活性較正常(chang)宮頸(jing)上皮(pi)細(xi)胞(bao)高(gao) 5 倍(bei)，可(ke)高(gao)效(xiao)降解(jie)宮(gong)頸(jing)間(jian)質的(de)膠(jiao)原(yuan)蛋白成(cheng)分(fen)。軟(ruan)瓊(qiong)脂克隆(long)形(xing)成(cheng)率(lv)達(da) 35%，克隆(long)形(xing)態呈不(bu)規(gui)則團塊狀，邊(bian)緣(yuan)有偽足樣(yang)突(tu)起(qi)，反映其(qi)侵襲(xi)性生長特(te)征(zheng)。凍存復(fu)蘇性(xing)能(neng)良(liang)好(hao)，液氮凍存後復蘇(su)存活率超 85%，連續傳(chuan)代 50 次後，SCC-Ag 表(biao)達(da)及侵(qin)襲能(neng)力無(wu)明顯(xian)衰(shuai)減(jian)，保(bao)證實(shi)驗(yan)的(de)穩(wen)定性與(yu)可(ke)重復(fu)性(xing)。
U14 細胞(bao)的(de)核(he)心(xin)價(jia)值體現(xian)在其(qi)對(dui)宮(gong)頸(jing)癌(ai)浸潤過(guo)程的(de)精(jing)準(zhun)模(mo)擬(ni)。在(zai)動(dong)物模型(xing)中，將 1×10⁶個(ge)細(xi)胞(bao)接(jie)種(zhong)於 615 小鼠(shu)宮頸(jing)黏膜下(xia)層(ceng)，12 天(tian)形(xing)成(cheng)原(yuan)發瘤，20 天(tian)腫(zhong)瘤穿透(tou)基底(di)膜，28 天(tian)浸潤至(zhi)宮(gong)頸(jing)肌層(ceng)，成(cheng)瘤率(lv) 100%，病(bing)理切片顯(xian)示腫(zhong)瘤組(zu)織(zhi)保(bao)留 CK17 表(biao)達(da)，呈浸潤性(xing)生長，破(po)壞宮頸(jing)腺(xian)體(ti)結(jie)構(gou)，與(yu)人(ren)類宮(gong)頸(jing)鱗癌(ai)的(de)浸潤模(mo)式高度壹致(zhi)。通(tong)過(guo)熒光(guang)標記追(zhui)蹤(zong)發現(xian)，腫瘤細(xi)胞(bao)首(shou)先(xian)破(po)壞宮頸(jing)黏膜上皮完(wan)整性，沿宮頸(jing)腺(xian)體(ti)間(jian)隙侵襲(xi)，逐(zhu)步(bu)穿透(tou)固(gu)有層(ceng)和(he)肌(ji)層，這(zhe)壹過(guo)程依賴細(xi)胞(bao)分(fen)泌(mi)的(de)透(tou)明質酸(suan)酶，可(ke)降(jiang)解(jie)宮頸(jing)間(jian)質中的(de)透(tou)明質酸(suan)屏(ping)障，透(tou)明質酸(suan)酶抑制劑(ji)處(chu)理可(ke)使(shi)浸潤深(shen)度減(jian)少 55%。
在發病(bing)機制(zhi)研究中，該細胞(bao)系(xi)揭示(shi)了(le)宮(gong)頸(jing)癌(ai)te有的(de)分(fen)子異常。基因測(ce)序(xu)顯(xian)示，細(xi)胞(bao)存在(zai) HPV16 E6/E7 整合(he)，導(dao)致 p53 蛋(dan)白降(jiang)解(jie)增(zeng)加(jia)和(he) Rb 蛋白(bai)功能失(shi)活，Western blot 檢測(ce)顯(xian)示 p53 表(biao)達(da)量較正常(chang)宮頸(jing)上皮(pi)細(xi)胞(bao)低(di) 60%，Rb 磷(lin)酸(suan)化水(shui)平(ping)高(gao) 3 倍，使(shi)細(xi)胞(bao)周(zhou)期(qi)檢查(zha)點(dian)失(shi)控，S 期(qi)比例增(zeng)加(jia) 30%。同(tong)時，細胞(bao)中 PI3K/Akt 信號(hao)通(tong)路(lu)異常激(ji)活，Akt 磷酸(suan)化水(shui)平(ping)高(gao) 4 倍，可(ke)促(cu)進(jin)抗雕亡蛋白 Bcl-2 表(biao)達(da)，Akt 抑制劑(ji)處(chu)理可(ke)使(shi)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖率下(xia)降(jiang) 50%，雕亡率上升 35%。與(yu)其(qi)他婦(fu)科腫瘤相(xiang)比(bi)，其(qi)表(biao)皮(pi)生長因子受體（EGFR）表(biao)達(da)更為(wei)顯(xian)著，蛋(dan)白(bai)水平高 3 倍(bei)，抑制 EGFR 可(ke)使(shi)細(xi)胞(bao)克隆(long)形(xing)成(cheng)率(lv)下(xia)降(jiang) 65%，證實(shi)其(qi)在腫(zhong)瘤增(zeng)殖中的(de)作(zuo)用(yong)。
在(zai)轉(zhuan)移機制研究(jiu)中，U14 細胞(bao)展(zhan)現(xian)出以淋巴(ba)轉移為(wei)主的(de)特(te)性。動(dong)物實(shi)驗(yan)顯(xian)示，35 天(tian)盆(pen)腔(qiang)淋巴(ba)結(jie)轉移(yi)率達(da) 70%，腹腔(qiang)種(zhong)植轉移率(lv)為(wei) 45%，血(xue)行轉移較少見(jian)（肺轉(zhuan)移率(lv) 20%），這(zhe)種(zhong)轉(zhuan)移(yi)模(mo)式與(yu)細胞(bao)高(gao)表(biao)達(da) CC 趨化因子受體 7（CCR7）相(xiang)關，該受體(ti)可(ke)與(yu)淋巴(ba)結(jie)中的(de) CCL21 結(jie)合(he)，流(liu)式細胞(bao)術(shu)檢(jian)測(ce)顯(xian)示其(qi)與(yu)淋巴(ba)結(jie)內皮細(xi)胞(bao)的(de)黏(nian)附率(lv)達(da) 45%，CCR7 抗體處(chu)理可(ke)使(shi)淋巴(ba)結(jie)轉移(yi)率下(xia)降(jiang) 60%。基因芯片分析(xi)顯(xian)示，轉(zhuan)移(yi)竈細(xi)胞(bao)中與(yu)上皮間(jian)質轉化相(xiang)關(guan)的(de) Twist 和(he) Snail 表(biao)達(da)上調，E - 鈣(gai)粘(zhan)蛋(dan)白(bai)表(biao)達(da)下(xia)降(jiang) 50%，使細胞(bao)獲(huo)得(de)遷(qian)移能(neng)力，沈默(mo) Twist 後，細胞(bao)遷(qian)移率(lv)下(xia)降(jiang) 55%。
在藥物篩選應(ying)用(yong)中，U14 細胞(bao)是(shi)評(ping)估(gu)宮(gong)頸(jing)癌(ai)治療(liao)藥物的(de)有效(xiao)工(gong)具。體外(wai)藥敏(min)實(shi)驗(yan)顯(xian)示，細(xi)胞(bao)對(dui)shun鉑敏(min)感(gan)性較高，半(ban)數(shu)抑制濃度（IC50）約 1.5μM，聯合(he)使(shi)用(yong) EGFR 抑制劑(ji)後，IC50 降至(zhi) 0.6μM，協同指(zhi)數(shu)為(wei) 0.6，證實(shi)聯(lian)合(he)用(yong)藥的(de)增(zeng)效(xiao)作(zuo)用(yong)。體(ti)內實(shi)驗(yan)中，該聯合(he)方(fang)案(an)可(ke)使(shi) 615 小鼠(shu)宮頸(jing)癌(ai)原(yuan)發瘤體(ti)積(ji)縮小 75%，淋巴(ba)結(jie)轉移(yi)率從 70% 降(jiang)至(zhi) 20%，療(liao)效(xiao)優(you)於單藥治療(liao)。基於其(qi) HPV 相關(guan)特(te)性，還可(ke)用(yong)於 HPV 相關(guan)宮頸(jing)癌(ai)的(de)靶向(xiang)藥物研究(jiu)，搭(da)載(zai) E6/E7 siRNA 的(de)納米藥物對(dui) U14 細(xi)胞(bao)的(de)抑制率(lv)達(da) 70%，顯(xian)著降(jiang)低(di)腫瘤組(zu)織(zhi)中 E6/E7 的(de)表(biao)達(da)量。
在(zai)腫(zhong)瘤微環(huan)境(jing)研(yan)究中，U14 細胞(bao)與(yu)宮頸(jing)成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞(bao)的(de)相(xiang)互作(zuo)用(yong)為(wei)解析腫(zhong)瘤進(jin)展(zhan)提供(gong)了(le)線索(suo)。共(gong)培養(yang)實(shi)驗(yan)顯(xian)示，成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞(bao)分(fen)泌(mi)的(de)轉(zhuan)化生長因子 -β（TGF-β）可(ke)激(ji)活腫瘤細(xi)胞(bao)的(de) Smad 通(tong)路(lu)，使 MMP-9 表(biao)達(da)上調 2.5 倍，侵(qin)襲(xi)能力增(zeng)強(qiang) 65%，TGF-β 中和抗體可(ke)阻斷這(zhe)種(zhong)促(cu)進(jin)作(zuo)用(yong)。在(zai)缺(que)氧(yang)微環(huan)境(jing)（1% O₂）中，細胞(bao) HIF-1α 表(biao)達(da)上調，誘(you)導(dao)血(xue)管內皮生長因子（VEGF）分泌(mi)增(zeng)加(jia)，促(cu)進腫(zhong)瘤血(xue)管生成(cheng)，VEGF 抗(kang)體(ti)處(chu)理可(ke)使(shi)腫(zhong)瘤微血(xue)管密度(du)減(jian)少 50%，為(wei)針對(dui)腫(zhong)瘤微環(huan)境(jing)的(de)治療(liao)提(ti)供實(shi)驗(yan)依據。
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