hTERT-BTY牛甲(jia)狀(zhuang)腺細(xi)胞系(xi)
hTERT-BTY牛甲(jia)狀(zhuang)腺細(xi)胞系(xi)作為(wei)牛源甲(jia)狀(zhuang)腺研(yan)究的突破(po)性(xing)永(yong)生化(hua)模型(xing)，以(yi)其(qi)穩(wen)定表達的(de)人(ren)端粒酶逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶（hTERT）和(he)完整的(de)甲(jia)狀(zhuang)腺濾泡上(shang)皮功能，在牛甲(jia)狀(zhuang)腺激(ji)素合(he)成機(ji)制解(jie)析、代謝調(tiao)控網絡(luo)研(yan)究及生物(wu)制藥(yao)生產中(zhong)具(ju)有不(bu)可替代的地位(wei)。與(yu) BTA-S2 黃牛皮膚(fu)細胞系(xi)的(de)成(cheng)纖維(wei)細胞特性(xing)及有限(xian)傳代能力(li)不(bu)同，該(gai)細胞(bao)系源自牛甲(jia)狀(zhuang)腺組(zu)織(zhi)並(bing)經(jing)永(yong)生化(hua)改造(zao)，為(wei)探(tan)索(suo)甲(jia)狀(zhuang)腺這壹關鍵(jian)內分(fen)泌(mi)器(qi)官的(de)生理(li)功能提(ti)供了長(chang)期穩(wen)定的實(shi)驗(yan)載體(ti)。
細(xi)胞(bao)起(qi)源與(yu)生物(wu)學(xue)特性(xing)
該(gai)細(xi)胞(bao)系源自健康成(cheng)年(nian)牛的甲(jia)狀(zhuang)腺濾泡組(zu)織(zhi)，通過(guo) 0.1% yi酶與(yu) 0.02% EDTA 聯合(he)消化(hua)法獲得(de)原(yuan)代甲(jia)狀(zhuang)腺濾泡上(shang)皮細胞(bao)後(hou)，經(jing)慢(man)病(bing)毒介(jie)導(dao)的(de) hTERT 基(ji)因(yin)轉染(ran)實(shi)現(xian)永(yong)生化(hua)，再經(jing)甲(jia)狀(zhuang)腺特(te)異性(xing)標(biao)誌(zhi)物(wu)甲(jia)狀(zhuang)腺球(qiu)蛋白(bai)（Tg）免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)篩選(xuan)純化(hua)建立。其(qi)核(he)心(xin)特征是(shi)高純(chun)度保(bao)留(liu)甲(jia)狀(zhuang)腺上(shang)皮細胞(bao)表(biao)型(xing)與(yu)永(yong)生化(hua)特性(xing)：Tg 陽性(xing)率達 98%，促甲(jia)狀(zhuang)腺激(ji)素受體(ti)（TSHR）表(biao)達(da)率 97%，而成纖維(wei)細(xi)胞(bao)標(biao)誌(zhi)物(wu)波形蛋(dan)白(bai)陽性(xing)率低於(yu) 1%，細胞純(chun)度較傳(chuan)統培養(yang)法提(ti)升 60%，顯(xian)著(zhu)高於(yu) BTA-S2 細胞系(xi)的皮膚(fu)成纖維(wei)特(te)性(xing)。
細(xi)胞(bao)形(xing)態呈現(xian)典型(xing)的(de)濾泡上(shang)皮樣，胞(bao)體(ti)呈(cheng)多(duo)邊形，直徑約(yue) 15-18μm，較(jiao) BTA-S2 細胞更小(xiao)，細胞(bao)核(he)呈(cheng)圓形(xing)（核(he)質(zhi)比約(yue) 1:3.5），排(pai)列呈單層或(huo)局(ju)部(bu)復(fu)層(ceng)，可形成類(lei)似(si)甲(jia)狀(zhuang)腺濾泡的(de)腺樣(yang)結(jie)構（直徑 50-80μm），與甲(jia)狀(zhuang)腺濾泡上(shang)皮的在(zai)體(ti)結(jie)構吻(wen)合(he)度達 95%。培養(yang)體(ti)系(xi)需(xu)模擬內(nei)分(fen)泌(mi)微環(huan)境：含 10% 胎牛血清(qing)的 F12K 培養(yang)基（添加 5μg/mL 胰(yi)島素(su)和(he) 10mIU/mL 促甲(jia)狀(zhuang)腺激(ji)素），在(zai) 37℃、5% CO₂環(huan)境下(xia)貼(tie)壁(bi)生長(chang)，倍(bei)增時間(jian)約(yue) 40-44 小(xiao)時（短於(yu) BTA-S2 細胞系(xi)）。傳代需(xu)在細胞融(rong)合(he)度達 80%-85% 時進(jin)行，采用(yong) 1:4 比例(li)接(jie)種(zhong)，碘缺乏(fa)環(huan)境（＜5μmol/L）會導(dao)致激(ji)素合(he)成功能下(xia)降（甲(jia)狀(zhuang)腺素(su) T4 分泌(mi)量減少(shao) 48%）。
功能驗(yan)證(zheng)顯(xian)示，該(gai)細(xi)胞(bao)系保(bao)留(liu)關鍵(jian)甲(jia)狀(zhuang)腺功能：碘攝(she)取率達 25%/24h，是 BTA-S2 細胞(bao)系(xi)的(de) 12.5 倍；甲(jia)狀(zhuang)腺素(su) T4 分泌(mi)量達 32ng/(10⁶細(xi)胞・24h)，三(san)碘甲(jia)狀(zhuang)腺原(yuan)氨酸(suan) T3 達(da) 8ng/(10⁶細胞・24h)；連續(xu)傳(chuan)代 100 次後仍(reng)保(bao)持(chi)核(he)型(xing)穩(wen)定（60 條染色(se)體(ti)，含(han)牛甲(jia)狀(zhuang)腺細(xi)胞特(te)異性(xing)核(he)型(xing)標(biao)記），端粒長(chang)度維持(chi)在 8-10kb（BTA-S2 細(xi)胞(bao)傳(chuan)代 25 後端粒縮短至 5kb），無(wu)支原體(ti)及牛源病(bing)原體(ti)汙染，永(yong)生化(hua)穩(wen)定性(xing)顯(xian)著(zhu)優(you)於(yu)原代甲(jia)狀(zhuang)腺細(xi)胞（傳(chuan)代 100 次後功能保(bao)留(liu)率 90% vs 傳代 15 次後 50%）。
核(he)心(xin)應用(yong)領(ling)域
甲(jia)狀(zhuang)腺激(ji)素合(he)成機(ji)制研(yan)究
hTERT-BTY 細胞(bao)系(xi)是解析牛甲(jia)狀(zhuang)腺激(ji)素合(he)成調(tiao)控網絡(luo)的(de)理(li)想模型(xing)。在(zai)激(ji)素合(he)成研(yan)究中(zhong)，該(gai)細(xi)胞系(xi)表現(xian)出典型(xing)的(de)內(nei)分(fen)泌(mi)特異性(xing)：促(cu)甲(jia)狀(zhuang)腺激(ji)素（TSH）刺(ci)激(ji)後，環(huan)磷suan腺苷(gan)（cAMP）水平升高 6.8 倍(bei)，而 BTA-S2 細胞(bao)系(xi)在相同處理(li)下(xia)無(wu)顯(xian)著(zhu)變(bian)化(hua)。通過(guo)該模型(xing)發現(xian)，牛甲(jia)狀(zhuang)腺過(guo)氧化(hua)物(wu)酶（TPO）基(ji)因(yin)啟動(dong)子(zi)區存(cun)在獨(du)te的(de) CREB 結(jie)合(he)位(wei)點，是 TSH 調(tiao)控激(ji)素合(he)成的(de)關鍵(jian)元(yuan)件(jian)，雙熒(ying)光(guang)素(su)酶實(shi)驗(yan)證(zheng)實(shi)該(gai)區(qu)域可使(shi)啟動(dong)子(zi)活性(xing)提(ti)升 7.2 倍(bei)，為(wei)理(li)解牛甲(jia)狀(zhuang)腺功能的激(ji)素調(tiao)控提(ti)供了直接(jie)證(zheng)據。此外(wai)，其(qi)鈉碘同向(xiang)轉運(yun)體(ti)（NIS）的(de)碘轉運(yun)活(huo)性(xing)達(da) 42pmol/(mg・min)，顯(xian)著(zhu)高於(yu)其(qi)他牛源細(xi)胞(bao)系(xi)（BTA-S2 細(xi)胞僅(jin)為(wei) 3.5pmol/(mg・min)），wan美模擬了甲(jia)狀(zhuang)腺的(de)碘濃聚(ju)功能。
甲(jia)狀(zhuang)腺疾病(bing)模型(xing)構(gou)建(jian)
在(zai)牛甲(jia)狀(zhuang)腺功能異常(chang)研(yan)究中(zhong)，該(gai)細(xi)胞系(xi)的應(ying)用(yong)價(jia)值尤為(wei)突出。對比正常(chang)與(yu)碘過量處理(li)的細(xi)胞系(xi)發現(xian)，後者(zhe)的(de)甲(jia)狀(zhuang)腺球(qiu)蛋白(bai)碘化(hua)水平下(xia)降 52%，促甲(jia)狀(zhuang)腺激(ji)素受體(ti)抗(kang)體(ti)（TRAb）表(biao)達(da)量增加 4.3 倍，與臨床(chuang)甲(jia)狀(zhuang)腺腫病(bing)例的(de)病(bing)理(li)特征吻(wen)合(he)度達 93%。而(er) BTA-S2 細胞(bao)系(xi)因(yin)缺乏(fa)甲(jia)狀(zhuang)腺特(te)異性(xing)功能，無(wu)法模擬此(ci)類(lei)病(bing)理(li)過程(cheng)。通過(guo)該模型(xing)建(jian)立的 "碘過量 - 甲(jia)狀(zhuang)腺炎(yan)" 體(ti)外(wai)模型(xing)，證(zheng)實(shi)炎(yan)癥(zheng)因(yin)子(zi) IL-6 可使(shi) TPO 活性(xing)下(xia)降 38%，為(wei)牛地方性(xing)甲(jia)狀(zhuang)腺腫的(de)發病(bing)機制提(ti)供了全新視角(jiao)。在(zai)藥(yao)物(wu)幹預研(yan)究中(zhong)，10μmol/L 的(de)硒(xi)代蛋氨(an)酸(suan)處理(li)可使(shi)該細胞系(xi)的(de)抗(kang)氧化(hua)能力(li)提(ti)升 55%，激(ji)素合(he)成功能恢復(fu) 42%，為(wei)甲(jia)狀(zhuang)腺疾病(bing)的營(ying)養(yang)調(tiao)控提(ti)供了劑(ji)量依據。
生物(wu)制藥(yao)生產平(ping)臺(tai)
該細(xi)胞系(xi)是重組(zu)甲(jia)狀(zhuang)腺蛋(dan)白(bai)生產的(de)優(you)質(zhi)載體(ti)。在(zai)重組(zu) Tg 蛋白(bai)表(biao)達(da)研(yan)究中(zhong)，hTERT-BTY 細(xi)胞(bao)的產(chan)量達 180μg/(10⁶細(xi)胞・24h)，是(shi) BTA-S2 細(xi)胞系(xi)的 9 倍(bei)，且蛋白(bai)糖(tang)基化(hua)修飾(shi)與(yu)天(tian)然(ran)甲(jia)狀(zhuang)腺組(zu)織(zhi)的壹致性(xing)達(da) 92%（CHO 細(xi)胞(bao)系僅為(wei) 75%）。通過(guo)該模型(xing)優(you)化(hua)的無(wu)血清(qing)培養(yang)體(ti)系(xi)，使(shi)重組(zu) TSH 的表(biao)達量提(ti)升至 250IU/L，且批次間(jian)差(cha)異率＜5%，顯(xian)著(zhu)優(you)於(yu)傳統原(yuan)代細胞(bao)（120IU/L，差(cha)異率 15%）。目前，該細胞系(xi)已用(yong)於(yu)牛甲(jia)狀(zhuang)腺功能檢測試(shi)劑(ji)盒(he)的抗原生產，使(shi)檢測靈敏度提(ti)升 3 倍(bei)，交叉反(fan)應率下(xia)降至＜1%。
與其(qi)他細胞(bao)系(xi)的(de)差(cha)異及協同(tong)
除與(yu) BTA-S2 細胞系(xi)差(cha)異顯(xian)著(zhu)外，與(yu)永(yong)生化(hua)牛垂(chui)體(ti)細(xi)胞(bao)系(xi)相比，hTERT-BTY 細(xi)胞的甲(jia)狀(zhuang)腺特(te)異性(xing)功能更強（T4 分泌(mi)量高 8 倍(bei)），而垂(chui)體(ti)細(xi)胞(bao)更(geng)適合(he)下(xia)丘腦(nao) - 垂(chui)體(ti) - 甲(jia)狀(zhuang)腺軸(zhou)的(de)上(shang)遊調(tiao)控研究。在牛內分(fen)泌(mi)網絡(luo)研(yan)究中(zhong)，該(gai)細(xi)胞系(xi)的激(ji)素分(fen)泌(mi)模式與(yu)下(xia)丘腦(nao)細胞(bao)系(xi)的(de)調(tiao)控信號存(cun)在顯(xian)著(zhu)相關性(xing)（相關系數 0.86），反(fan)映了內分泌(mi)軸(zhou)的(de)協(xie)同作用(yong)。兩者可協同用(yong)於(yu)構建 "下(xia)丘腦(nao) - 垂(chui)體(ti) - 甲(jia)狀(zhuang)腺" 軸(zhou)的(de)體(ti)外(wai)模型(xing)，全(quan)面(mian)解(jie)析牛的代謝調(tiao)控網絡(luo)。
優(you)勢(shi)與(yu)局(ju)限(xian)性(xing)
優(you)勢(shi)體(ti)現(xian)在：永(yong)生化(hua)特性(xing)實(shi)現(xian)長(chang)期穩(wen)定培養(yang)（＞100 代），解決(jue)了原代甲(jia)狀(zhuang)腺細(xi)胞傳(chuan)代受限(xian)的難題；完整保(bao)留(liu)甲(jia)狀(zhuang)腺激(ji)素合(he)成功能，是內分(fen)泌(mi)研究的標(biao)準(zhun)模型(xing)；重組(zu)蛋白(bai)表(biao)達(da)量高且修飾(shi)天(tian)然(ran)，適合(he)生物(wu)制藥(yao)生產。局(ju)限(xian)性(xing)包(bao)括(kuo)：永(yong)生化(hua)可能導(dao)致部(bu)分(fen)應(ying)激(ji)通路(lu)改變(bian)（hTERT 過表達(da)使(shi)應激(ji)激(ji)素皮zhi醇(chun)敏(min)感(gan)性(xing)下(xia)降 15%）；無(wu)法wan全模擬甲(jia)狀(zhuang)腺的(de)三維(wei)濾泡結(jie)構（需(xu)類(lei)器(qi)官培養(yang)彌(mi)補(bu)）；對(dui)非(fei)內(nei)分泌(mi)幹擾(rao)物(wu)的響應(ying)靈敏度較低(di)（如重金屬毒性(xing)檢(jian)測誤(wu)差(cha)率＞8%）。
研究意義與展望
該細胞系(xi)的(de)建(jian)立突破(po)了牛甲(jia)狀(zhuang)腺研(yan)究的技術(shu)瓶頸(jing)，推(tui)動(dong)甲(jia)狀(zhuang)腺功能研究從(cong)短期原代實(shi)驗(yan)進(jin)入(ru)長(chang)期機制探(tan)索(suo)，目前已被(bei) 40% 的(de)動(dong)物(wu)內分泌(mi)實(shi)驗(yan)室采用(yong)，用(yong)於(yu) 12 項(xiang)牛甲(jia)狀(zhuang)腺相關研究。未(wei)來通過(guo)基因(yin)編(bian)輯技術(shu)敲(qiao)除 hTERT 的(de)潛在幹(gan)擾(rao)位(wei)點（目前幹擾(rao)率 15%），結(jie)合(he)微流控芯片構建 "甲(jia)狀(zhuang)腺 - 血(xue)管(guan)" 共(gong)培養(yang)模型(xing)（目前單層培養(yang)功能模擬度 80%），有望進(jin)壹步(bu)提(ti)升其(qi)在精(jing)準(zhun)內(nei)分泌(mi)研究中(zhong)的(de)價(jia)值。作為(wei)牛甲(jia)狀(zhuang)腺研(yan)究的標(biao)gan模型(xing)，它不(bu)僅為(wei)反(fan)芻(chu)動(dong)物(wu)內分泌(mi)調(tiao)控提(ti)供了關鍵(jian)工具(ju)，也為(wei)人(ren)類(lei)甲(jia)狀(zhuang)腺疾病(bing)的比較(jiao)醫學(xue)研究搭建了重要橋(qiao)梁。
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