BTA-S2黃(huang)牛皮(pi)膚細胞系(xi)
BTA-S2黃牛皮(pi)膚細胞系(xi)作(zuo)為黃牛物(wu)種(zhong)特(te)異性研(yan)究的核心(xin)貼壁(bi)模型，以其穩定的(de)成纖(xian)維(wei)細胞功(gong)能(neng)和(he)典(dian)型(xing)的(de)地方(fang)黃牛遺(yi)傳特(te)征，在(zai)黃(huang)牛皮(pi)膚生(sheng)理(li)機(ji)制(zhi)解析、地方(fang)品種(zhong)遺傳資源(yuan)保護(hu)及適應性育種(zhong)研(yan)究中具有(you)不可替(ti)代(dai)的(de)地位(wei)。與(yu) Psp-EFGP-Iprl 荷斯坦(tan)奶(nai)牛胎(tai)兒(er)成纖(xian)維(wei)細胞的轉(zhuan)基(ji)因研(yan)究定位(wei)不(bu)同，該細(xi)胞系(xi)源自地方(fang)黃牛的(de)皮(pi)膚組(zu)織(zhi)，為探索(suo)黃(huang)牛的(de)品種(zhong)特(te)異性表(biao)型(xing)及遺傳多樣性提(ti)供(gong)了天然(ran)實(shi)驗載(zai)體。
細胞起(qi)源與(yu)生(sheng)物(wu)學(xue)特(te)性
該(gai)細(xi)胞系(xi)源自健康成年地方(fang)黃牛的(de)頸部(bu)皮(pi)膚組(zu)織(zhi)，通過(guo) 0.2% 膠(jiao)原酶(mei)與(yu) 0.15%yi酶(mei)聯(lian)合消化(hua)法(fa)獲(huo)得原(yuan)代成纖(xian)維(wei)細胞後(hou)，經成纖(xian)維(wei)細胞特(te)異性標誌(zhi)物波(bo)形蛋白(bai)（Vimentin）免(mian)疫熒(ying)光篩(shai)選(xuan)純化(hua)建(jian)立。其核(he)心特(te)征是(shi)高(gao)純度保留黃牛皮(pi)膚成纖(xian)維(wei)細胞的表型：波(bo)形蛋白(bai)陽(yang)性率(lv)達 98%，皮(pi)膚特(te)異性角蛋(dan)白(bai) 14（K14）表(biao)達率 96%，而(er)上(shang)皮(pi)細胞標誌(zhi)物 CK18 表(biao)達率低(di)於(yu) 1%，細(xi)胞純度較傳統(tong)組(zu)織(zhi)塊(kuai)培(pei)養(yang)法(fa)提升(sheng) 55%，顯(xian)著高(gao)於(yu)轉(zhuan)基(ji)因荷斯坦(tan)細(xi)胞系(xi)的胎(tai)兒(er)成纖(xian)維(wei)特(te)性。
細(xi)胞形態呈(cheng)現(xian)典(dian)型(xing)的(de)長梭(suo)形成纖(xian)維(wei)樣，胞體長度約(yue) 105-125μm，寬度約(yue) 17-20μm，較 Psp-EFGP-Iprl 荷斯坦(tan)細(xi)胞略(lve)小(xiao)，細胞核呈(cheng)長(chang)橢(tuo)圓(yuan)形（核質(zhi)比(bi)約(yue) 1:4.6），排列呈(cheng)束(shu)狀，與(yu)地方(fang)黃牛皮(pi)膚成纖(xian)維(wei)細胞的固有(you)表型(xing)吻合度達 95%。培(pei)養(yang)體系(xi)需(xu)模(mo)擬溫(wen)帶(dai)環境(jing)特(te)征：含(han) 10% 胎(tai)牛血(xue)清的(de) DMEM 培(pei)養(yang)基(ji)（添(tian)加 0.2mmol/L 維(wei)生(sheng)素(su) C），在(zai) 37℃、5% CO₂環境(jing)下(xia)貼壁(bi)生(sheng)長(chang)，倍(bei)增(zeng)時(shi)間約(yue) 46-50 小(xiao)時(shi)（短於轉(zhuan)基(ji)因荷斯坦(tan)細(xi)胞系(xi)）。傳代需(xu)在(zai)細(xi)胞融合度達 80%-85% 時(shi)進(jin)行(xing)，采用 1:3 比(bi)例(li)接種(zhong)，低(di)溫(wen)環境(jing)（＜30℃）會(hui)導致細(xi)胞增殖停(ting)滯(zhi)（Ki67 陽(yang)性率(lv)下(xia)降(jiang) 42%）。
功(gong)能(neng)驗證顯示(shi)，該(gai)細胞系(xi)保留關鍵(jian)皮(pi)膚功(gong)能(neng)：膠(jiao)原(yuan)蛋(dan)白(bai)合成速率(lv)達 18μg/(10⁶細胞・24h)，是轉(zhuan)基(ji)因荷斯坦(tan)細(xi)胞系(xi)的 1.3 倍(bei)；連(lian)續(xu)傳代 25 次後(hou)仍保持核型穩定（60 條(tiao)染色體，含地方(fang)黃牛特(te)異性染(ran)色體帶(dai)型標記(ji)），無支(zhi)原(yuan)體及牛源(yuan)病原體汙染，遺(yi)傳穩定性(xing)顯(xian)著優(you)於(yu)原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)細(xi)胞（傳代 20 次後(hou)核(he)型(xing)異常(chang)率＜2.5% vs 12%），且(qie)未檢(jian)測到外源基(ji)因(yin)整(zheng)合（與(yu)轉(zhuan)基(ji)因荷斯坦(tan)細(xi)胞系(xi)的核(he)心(xin)差(cha)異）。
核心(xin)應(ying)用領(ling)域
黃牛皮(pi)膚特(te)性研(yan)究
BTA-S2 細胞系(xi)是解(jie)析(xi)地方(fang)黃牛皮(pi)膚功(gong)能(neng)特(te)性的(de)理(li)想模(mo)型(xing)。在毛(mao)發(fa)相關(guan)基因研(yan)究中，該細(xi)胞系(xi)表現(xian)出(chu)典(dian)型(xing)的(de)品種(zhong)特(te)異性：毛(mao)囊(nang)誘(you)導(dao)因(yin)子 β-catenin 的表達量是(shi) Psp-EFGP-Iprl 荷斯坦(tan)細(xi)胞系(xi)的 2.1 倍(bei)，且(qie)在(zai)睪酮處(chu)理(li)後(hou)表(biao)達量增(zeng)加(jia) 3.8 倍，而荷斯坦(tan)細(xi)胞無顯著變(bian)化(hua)。通過(guo)該(gai)模型(xing)發(fa)現，地方(fang)黃牛 KRT71 基(ji)因(yin)存在獨te的品種(zhong)特(te)異性變(bian)異（第 326 位(wei)絲(si)an酸→脯an酸），導(dao)致其(qi)毛(mao)發(fa)纖(xian)維(wei)強度比(bi)荷斯坦(tan)奶(nai)牛高(gao) 25%，為黃牛適(shi)應(ying)粗飼環境(jing)的(de)皮(pi)膚保護(hu)機(ji)制(zhi)提供了(le)直(zhi)接(jie)證據(ju)。此外，其皮(pi)膚抗氧(yang)化(hua)酶(mei) SOD 活(huo)性(xing)達 65U/mg・prot，顯著高(gao)於(yu)荷斯坦(tan)細(xi)胞（48U/mg・prot），反映(ying)了(le)地方(fang)黃牛對(dui)野(ye)外環境(jing)的(de)適應優(you)勢(shi)。
地方(fang)遺傳資源(yuan)保存
在地方(fang)黃牛品種(zhong)資源(yuan)庫(ku)構(gou)建(jian)中，該(gai)細胞系(xi)的應(ying)用價(jia)值尤(you)為突出(chu)。對(dui)比(bi)冷(leng)凍(dong)保存的 BTA-S2 細胞與(yu)原(yuan)代(dai)細(xi)胞的活性發(fa)現，前(qian)者的復蘇(su)存(cun)活率(lv)達 81%，顯著高(gao)於(yu)普(pu)通黃(huang)牛原(yuan)代(dai)細胞（63%），且解凍(dong)後(hou)第(di) 3 代(dai)細(xi)胞的遺傳標記(ji)穩定性(xing)（STR 位(wei)點匹(pi)配率 99.8%）與(yu)新鮮細胞無顯著差(cha)異（99.9%），冷(leng)凍(dong)性能(neng)與(yu)轉(zhuan)基(ji)因荷斯坦(tan)細(xi)胞系(xi)相當(dang)（復蘇(su)率(lv) 81% vs 82%）。通過(guo)該(gai)模型(xing)建立的 "梯(ti)度降溫(wen) - 低(di)溫(wen)保護(hu)" 技(ji)術(shu)體系(xi)，使(shi)地方(fang)黃牛遺(yi)傳物質(zhi)的(de)長期(qi)保存年限延長至(zhi) 30 年以上(shang)，目前已納(na)入(ru)國家地方(fang)畜禽(qin)遺(yi)傳資源(yuan)庫(ku)。在品種(zhong)鑒(jian)定研(yan)究中，證實(shi) BTA-S2 細(xi)胞的 10 個微衛(wei)星(xing)位(wei)點組(zu)合可實(shi)現(xian) 99.6% 的(de)品種(zhong)區分率，優(you)於(yu)傳統(tong)血(xue)液樣本(ben)（95.2%）。
黃牛適(shi)應(ying)性育種(zhong)研(yan)究
該細胞系(xi)是地方(fang)黃牛品種(zhong)改良(liang)的(de)核(he)心(xin)篩選(xuan)工具。在(zai)耐寒(han)基因(yin)研(yan)究中，BTA-S2 細胞的冷(leng)休(xiu)克(ke)蛋白(bai) CSPB 表(biao)達量在(zai) 15℃低(di)溫(wen)處(chu)理後(hou)是(shi)常(chang)溫(wen)組(zu)的 5.2 倍，而荷斯坦(tan)細(xi)胞僅增加(jia) 1.8 倍，通過(guo) CRISPR 技(ji)術(shu)編(bian)輯(ji)該基(ji)因後(hou)，細(xi)胞耐寒(han)能(neng)力(li)提(ti)升(sheng) 40%，為培(pei)育耐寒(han)改良(liang)品種(zhong)提供(gong)了(le)細(xi)胞水(shui)平證據(ju)。在飼料添(tian)加劑(ji)測試(shi)中(zhong)，20μmol/L 的(de)黃芪duo糖處理可使(shi)該細胞系(xi)的抗氧(yang)化(hua)基(ji)因(yin) GPX 表(biao)達量提(ti)升(sheng) 55%，且(qie)膠(jiao)原(yuan)蛋(dan)白合成增加(jia) 28%，為黃牛皮(pi)膚健康的營(ying)養(yang)調控提供(gong)了(le)劑(ji)量依(yi)據(ju)。與(yu)轉(zhuan)基(ji)因荷斯坦(tan)細(xi)胞系(xi)相比(bi)，其更(geng)適(shi)合地方(fang)品種(zhong)的傳統(tong)育種(zhong)研(yan)究（無外源基(ji)因(yin)幹擾）。
與(yu)其(qi)他(ta)細胞系(xi)的差(cha)異及協同
除與(yu) Psp-EFGP-Iprl 荷斯坦(tan)細(xi)胞系(xi)差異顯著外，與(yu)西(xi)門(men)塔爾(er)牛皮(pi)膚細胞系(xi)相比(bi)，BTA-S2 細胞的地方(fang)品種(zhong)特(te)異性基(ji)因(yin)表達更(geng)豐(feng)富（168 個差異表達基因(yin)），且(qie)對(dui)粗(cu)飼料代(dai)謝(xie)相關(guan)的(de)皮(pi)膚保護(hu)功(gong)能(neng)更(geng)強(qiang)（角質(zhi)層(ceng)厚度相關基因(yin)表(biao)達高(gao) 18%）。在(zai)黃(huang)牛屬(shu)適應(ying)性比(bi)較研(yan)究中，BTA-S2 細胞的環境(jing)應(ying)答基因(yin)表(biao)達模式與(yu)牦(mao)牛皮(pi)膚細胞系(xi)存在(zai)顯(xian)著相(xiang)關(guan)性（相(xiang)關系(xi)數(shu) 0.76），反映(ying)了(le)牛屬(shu)動物(wu)對(dui)不(bu)同生(sheng)態環境(jing)的(de)適應分化(hua)。兩者可協同用於(yu)解(jie)析牛科(ke)動(dong)物的適應性進化(hua)網(wang)絡(luo)，為跨品種(zhong)育種(zhong)提供(gong)參(can)考(kao)。
優(you)勢(shi)與(yu)局(ju)限性(xing)
優(you)勢(shi)體現在(zai)：保留地方(fang)黃牛的(de)天(tian)然(ran)遺(yi)傳特(te)性，無(wu)外源基(ji)因(yin)幹擾，是(shi)傳統(tong)育種(zhong)研(yan)究的標準(zhun)模型(xing)；皮(pi)膚功(gong)能(neng)相(xiang)關(guan)基(ji)因(yin)表達穩定，為品種(zhong)特(te)異性表(biao)型(xing)研(yan)究提供可靠(kao)工具；冷(leng)凍(dong)保存性能(neng)優(you)異，適合地方(fang)遺傳資源(yuan)的(de)長期(qi)保存。局(ju)限性(xing)包括：成纖(xian)維(wei)細胞無法(fa)wan全模(mo)擬皮(pi)膚的復層(ceng)結(jie)構（需(xu)共培(pei)養(yang)技(ji)術(shu)彌(mi)補(bu)）；長期傳代後(hou)存(cun)在(zai)端粒(li)縮(suo)短（25 代後(hou)縮(suo)短 1.0kb）；對(dui)轉(zhuan)基(ji)因操(cao)作(zuo)的(de)兼容(rong)性(xing)低(di)於(yu)胎(tai)兒(er)成纖(xian)維(wei)細胞（轉(zhuan)染(ran)效率(lv) 35% vs 58%）。
研(yan)究意義與(yu)展望(wang)
該細(xi)胞系(xi)的建(jian)立填bu了地方(fang)黃牛皮(pi)膚細胞模型的空(kong)白(bai)，推(tui)動了(le)黃牛研(yan)究從(cong)群(qun)體水(shui)平深(shen)入(ru)到(dao)細(xi)胞分子層(ceng)面，目前已用於(yu) 7 項(xiang)地方(fang)黃牛品種(zhong)特(te)異性基(ji)因(yin)功(gong)能(neng)研(yan)究及 2 個省(sheng)級黃(huang)牛育種(zhong)項目。未來通過(guo)單(dan)細胞測序技術(shu)解(jie)析(xi)細胞異質性(xing)（目前均質化(hua)培(pei)養(yang)模(mo)擬度 70%），結(jie)合類器官培(pei)養(yang)構(gou)建(jian) "皮(pi)膚 - 毛(mao)囊(nang)" 復合模型，有望(wang)更(geng)全(quan)面模(mo)擬黃(huang)牛皮(pi)膚的生(sheng)理(li)功(gong)能(neng)。作(zuo)為地方(fang)黃牛研(yan)究的基礎(chu)模型，它(ta)不(bu)僅為地方(fang)品種(zhong)的保護(hu)與(yu)利(li)用提(ti)供(gong)了科(ke)學(xue)工具，也(ye)為理解(jie)中(zhong)國黃牛的(de)du特(te)適應(ying)性(xing)提(ti)供了(le)重(zhong)要參考(kao)。
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