Psp-EFGP-Iprl荷斯(si)坦(tan)奶牛胎(tai)兒成纖(xian)維細胞(bao)系
Psp-EFGP-Iprl荷斯(si)坦(tan)奶牛胎(tai)兒成纖(xian)維細胞(bao)系作為(wei)荷斯(si)坦(tan)奶牛轉(zhuan)基(ji)因(yin)研(yan)究的核(he)心模型(xing)，以(yi)其穩(wen)定(ding)整合(he)的增(zeng)強型(xing)綠色(se)熒光蛋白(bai)（EGFP）標(biao)記(ji)與 Iprl 基(ji)因(yin)表(biao)達 cassette，在(zai)乳(ru)腺特(te)異性(xing)基(ji)因(yin)功能解析(xi)、轉(zhuan)基(ji)因(yin)奶牛制(zhi)備及生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)優化中具有不(bu)可替代(dai)的地位(wei)。與 MDBK (BVDV-free) 牛腎細胞(bao)系的病(bing)毒(du)學(xue)研(yan)究定(ding)位不(bu)同，該(gai)細胞(bao)系源(yuan)自(zi)荷斯(si)坦(tan)奶牛胎(tai)兒的成(cheng)纖(xian)維組織(zhi)，經(jing)基(ji)因(yin)工程(cheng)改(gai)造後(hou)，為(wei)探(tan)索(suo)乳(ru)腺特(te)異性(xing)表(biao)達調控(kong)機(ji)制及(ji)重組蛋白(bai)生產(chan)提(ti)供(gong)了可視化(hua)實(shi)驗載(zai)體(ti)。
細胞(bao)起(qi)源(yuan)與生物學(xue)特(te)性(xing)
該(gai)細胞(bao)系源(yuan)自(zi)妊(ren)娠(shen) 45 日齡(ling)健康(kang)荷斯(si)坦(tan)奶牛胎(tai)兒的背(bei)部(bu)肌(ji)肉組織(zhi)，通過 0.2% 膠(jiao)原酶消(xiao)化(hua)法獲(huo)得原代(dai)成纖(xian)維細胞(bao)後(hou)，經慢(man)病(bing)毒介導的 Psp 啟(qi)動子（乳(ru)腺特(te)異性(xing)啟(qi)動子）驅(qu)動 EGFP 與 Iprl 融合(he)基(ji)因(yin)穩(wen)定(ding)轉染建立(li)。其核(he)心特(te)征(zheng)是高純(chun)度(du)保留(liu)胎兒(er)成纖(xian)維細胞(bao)表(biao)型(xing)與轉基(ji)因(yin)穩(wen)定(ding)性(xing)：波(bo)形(xing)蛋白(bai)（Vimentin）陽性(xing)率(lv)達(da) 98%，EGFP 陽性(xing)率(lv)＞95%（流式(shi)細胞(bao)術(shu)檢(jian)測），上(shang)皮(pi)細胞(bao)標(biao)誌(zhi)物(wu) CK18 表(biao)達率(lv)低(di)於(yu) 1%，細胞(bao)純(chun)度(du)較(jiao)傳(chuan)統(tong)轉基(ji)因(yin)方(fang)法提(ti)升 40%，顯(xian)著高於(yu) MDBK 細胞(bao)系的上(shang)皮(pi)細胞(bao)特(te)性(xing)。
細胞(bao)形(xing)態呈現(xian)典(dian)型(xing)的長(chang)梭(suo)形(xing)成(cheng)纖(xian)維樣(yang)，胞(bao)體(ti)長度(du)約 110-130μm，寬(kuan)度(du)約 18-22μm，較(jiao) MDBK 細胞(bao)更(geng)大(da)，細胞(bao)核(he)呈橢(tuo)圓形（核(he)質比(bi)約 1:4.5），排(pai)列呈漩(xuan)渦狀(zhuang)，在(zai)熒(ying)光顯(xian)微鏡下(xia)可見穩(wen)定(ding)的綠色(se)熒光（激發波(bo)長 488nm），與胎兒成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)的增(zeng)殖特性(xing)吻(wen)合(he)度(du)達 96%。培養體(ti)系需(xu)優化為(wei)：含(han) 15% 胎(tai)牛(niu)血(xue)清(qing)的 DMEM 高(gao)糖(tang)培養基(ji)（添(tian)加 2ng/mL 堿性(xing)成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)生(sheng)長(chang)因(yin)子），在 37℃、5% CO₂環境下(xia)貼壁(bi)生長(chang)，倍(bei)增(zeng)時間約 48-52 小(xiao)時（長於(yu) MDBK 細胞(bao)系）。傳(chuan)代(dai)需在(zai)細胞(bao)融合(he)度(du)達 70%-75% 時進(jin)行(xing)，采用(yong) 1:3 比例(li)接(jie)種(zhong)，過度(du)密(mi)集(ji)會導(dao)致(zhi)轉(zhuan)基(ji)因(yin)沈默（EGFP 熒光強度(du)下降(jiang) 35%）。
功能驗證(zheng)顯(xian)示，該細胞(bao)系保(bao)留(liu)關鍵(jian)轉基(ji)因(yin)功能：Iprl 基(ji)因(yin) mRNA 表(biao)達量(liang)達(da) 2.8×10⁵拷(kao)貝(bei) /μg RNA，Western blot 檢測可見 45kDa 融合(he)蛋白(bai)；經 50 代(dai)傳代(dai)後(hou)，EGFP 陽性(xing)率(lv)仍保(bao)持(chi) 92%，核(he)型(xing)穩(wen)定(ding)（60 條染色(se)體(ti)，含(han)荷斯(si)坦(tan)奶牛特(te)異性(xing)核(he)型(xing)標(biao)記(ji)），無支(zhi)原體(ti)及逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)病毒汙(wu)染，轉(zhuan)基(ji)因(yin)穩(wen)定(ding)性(xing)顯(xian)著優於(yu)瞬時轉染細胞(bao)（傳(chuan)代(dai) 20 次後(hou)陽性(xing)率(lv) 90% vs 30%）。
核(he)心應用(yong)領域(yu)
乳(ru)腺特(te)異性(xing)啟(qi)動子功能研(yan)究
Psp-EFGP-Iprl 細胞(bao)系是(shi)解(jie)析(xi)乳(ru)腺特(te)異性(xing)表(biao)達調控(kong)網絡的理想(xiang)模型(xing)。在(zai)啟(qi)動子活(huo)性(xing)研(yan)究中，該細胞(bao)系表(biao)現出典(dian)型(xing)的組織(zhi)特(te)異(yi)性(xing)：經(jing)催(cui)乳(ru)素處(chu)理後(hou)，Psp 啟(qi)動子驅(qu)動的 EGFP 表(biao)達量(liang)增(zeng)加 6.3 倍(bei)，而(er) MDBK 細胞(bao)系因(yin)缺(que)乏乳(ru)腺分(fen)化信(xin)號，EGFP 表(biao)達無(wu)顯(xian)著變化(hua)。通過該模型(xing)發(fa)現(xian)，Psp 啟(qi)動子區存在 3 個乳(ru)腺特(te)異性(xing)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子 STAT5 的結(jie)合(he)位點，是其激素應答的關(guan)鍵(jian)調控(kong)元(yuan)件，雙(shuang)熒光素酶報告(gao)基(ji)因(yin)實(shi)驗證(zheng)實該(gai)區域可使啟(qi)動子活(huo)性(xing)提(ti)升 8.7 倍(bei)，為(wei)乳(ru)腺生(sheng)物反應器(qi)的啟(qi)動子優化提(ti)供(gong)了直(zhi)接(jie)證(zheng)據。此(ci)外，其啟(qi)動子甲基(ji)化(hua)水平在(zai)傳代(dai)過程中保持(chi)穩定(ding)（甲基(ji)化(hua)率＜5%），解決了傳統(tong)轉基(ji)因(yin)細胞(bao)的表(biao)觀遺(yi)傳(chuan)沈默問題(ti)。
轉基(ji)因(yin)克(ke)隆胚(pei)胎(tai)制(zhi)備
在體(ti)細胞(bao)核(he)移(yi)植(zhi)研(yan)究中，該細胞(bao)系的應用(yong)價值(zhi)尤(you)為(wei)突出。對(dui)比(bi)普(pu)通胎兒(er)成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)發(fa)現(xian)，該(gai)細胞(bao)系的核(he)移(yi)植(zhi)卵(luan)裂率達(da) 82%，囊胚(pei)率(lv)達(da) 38%，顯(xian)著高於(yu)未(wei)轉基(ji)因(yin)細胞(bao)（65%、25%），且(qie)囊(nang)胚(pei)中 EGFP 陽性(xing)率(lv)達(da) 91%（普(pu)通轉基(ji)因(yin)方(fang)法為(wei) 62%）。通過該模型(xing)建立(li)的 "轉(zhuan)基(ji)因(yin)細胞(bao) - 去(qu)核(he)卵(luan)母細胞(bao)" 融合(he)體(ti)系，使(shi)荷斯(si)坦(tan)奶牛的克(ke)隆效(xiao)率提(ti)升至(zhi) 18%（傳(chuan)統(tong)方(fang)法為(wei) 10%），目(mu)前已用(yong)於(yu) 3 批轉基(ji)因(yin)奶牛的制(zhi)備，其中 2 頭(tou)犢(du)牛(niu)成(cheng)功表(biao)達 EGFP 熒(ying)光（整合(he)位點檢測證(zheng)實為(wei)單(dan)拷(kao)貝(bei)插(cha)入）。與 MDBK 細胞(bao)系相(xiang)比(bi)，其作為(wei)核(he)供(gong)體(ti)的胚(pei)胎(tai)發(fa)育能力(li)更優（囊胚(pei)率(lv)高(gao) 13%），因(yin)成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)更(geng)接(jie)近(jin)胚(pei)胎(tai)發(fa)育的表(biao)觀遺(yi)傳(chuan)狀(zhuang)態。
重組蛋白(bai)表(biao)達優化
該(gai)細胞(bao)系是(shi)乳(ru)腺生(sheng)物反應器(qi)的重(zhong)組蛋白(bai)篩選(xuan)平臺。在(zai) Iprl 蛋白(bai)功能研(yan)究中，ELISA 檢測顯(xian)示細胞(bao)分(fen)泌的重(zhong)組蛋白(bai)達 12μg/(10⁶細胞(bao)・24h)，且(qie)具有完整(zheng)的生(sheng)物(wu)學(xue)活(huo)性(xing)（體(ti)外抑(yi)菌實(shi)驗顯(xian)示對(dui)金(jin)黃(huang)色(se)pu萄球(qiu)菌(jun)的抑(yi)制率(lv)達 90%）。在表(biao)達系統(tong)優化中，該細胞(bao)系證(zheng)實添(tian)加 0.5mmol/L 丁酸鈉(na)可使重(zhong)組蛋白(bai)產(chan)量提(ti)升 2.1 倍(bei)，且蛋白(bai)糖(tang)基(ji)化(hua)修飾與乳(ru)腺組織(zhi)分(fen)泌的天(tian)然蛋白(bai)壹(yi)致(zhi)性(xing)達(da) 92%（MDBK 細胞(bao)系僅(jin)為(wei) 68%）。某(mou)新型(xing)抗(kang)凝(ning)蛋白(bai)的表(biao)達測試顯(xian)示，該細胞(bao)系的重(zhong)組蛋白(bai)活(huo)性(xing)是(shi) CHO 細胞(bao)系的 1.8 倍(bei)，為(wei)乳(ru)腺特(te)異性(xing)高(gao)活(huo)性(xing)蛋白(bai)生產(chan)提(ti)供(gong)了依據。
與其他(ta)細胞(bao)系的差(cha)異及(ji)協同
除(chu)與 MDBK 細胞(bao)系差(cha)異顯(xian)著外，與普(pu)通荷斯(si)坦(tan)胎兒(er)成纖(xian)維細胞(bao)相(xiang)比(bi)，該(gai)細胞(bao)系的轉(zhuan)基(ji)因(yin)穩(wen)定(ding)性(xing)更(geng)高(gao)（50 代(dai)陽性(xing)率(lv)高(gao) 62%），且(qie)可通過熒光快(kuai)速篩選(xuan)。在轉(zhuan)基(ji)因(yin)動物(wu)制備研(yan)究中，該細胞(bao)系的核(he)移(yi)植(zhi)胚(pei)胎(tai)與乳(ru)腺上(shang)皮細胞(bao)系的共培養體(ti)系可使囊(nang)胚(pei)率(lv)提(ti)升 15%（相(xiang)關系數(shu) 0.82），反(fan)映了細胞(bao)間(jian)信(xin)號對(dui)胚(pei)胎(tai)發(fa)育的促(cu)進(jin)作用(yong)。兩者可協同用(yong)於(yu)構(gou)建 "轉基(ji)因(yin)供(gong)體(ti)細胞(bao) - 乳(ru)腺分(fen)化模型(xing)"，全面解(jie)析(xi)重(zhong)組蛋白(bai)從表(biao)達至(zhi)分(fen)泌的完整(zheng)路(lu)徑。
優勢與局限性(xing)
優勢體(ti)現在(zai)：整(zheng)合(he)了可視化(hua)標(biao)記(ji)與功能基(ji)因(yin)，實(shi)現轉基(ji)因(yin)細胞(bao)的實(shi)時追蹤；乳(ru)腺特(te)異性(xing)啟(qi)動子在激素誘(you)導(dao)下可高效(xiao)激活(huo)，模擬(ni)體(ti)內表(biao)達模式；核(he)移(yi)植(zhi)效(xiao)率高(gao)，是轉(zhuan)基(ji)因(yin)克(ke)隆的優質供(gong)體(ti)細胞(bao)。局限性(xing)包(bao)括(kuo)：成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)無(wu)法(fa)wan全模擬(ni)乳(ru)腺上(shang)皮的分(fen)泌功能（需誘(you)導(dao)分(fen)化技(ji)術彌(mi)補）；長期傳代(dai)存在(zai)基(ji)因(yin)表(biao)達漂(piao)移(yi)（50 代(dai)後(hou) Iprl 表(biao)達量(liang)下(xia)降(jiang) 18%）；對(dui)非(fei)成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)特(te)異(yi)性(xing)病(bing)毒(du)的敏感(gan)性(xing)低(di)（如牛(niu)皰疹病毒(du)感(gan)染率(lv)＜8%）。
研(yan)究意義與展望(wang)
該(gai)細胞(bao)系的建立(li)推動了轉基(ji)因(yin)奶牛研(yan)究從經(jing)驗性(xing)操(cao)作進(jin)入(ru)精準(zhun)調控(kong)時代(dai)，目前已被(bei)用(yong)於(yu) 8 種(zhong)重(zhong)組蛋白(bai)的乳(ru)腺表(biao)達研(yan)究，其中 2 種(zhong)進(jin)入(ru)臨(lin)床(chuang)前試驗。未(wei)來通過 CRISPR/Cas9 技(ji)術實(shi)現定(ding)點整合(he)（目前隨機(ji)整合(he)效(xiao)率 70%），結(jie)合(he) 3D 類器(qi)官培養模擬(ni)乳(ru)腺微(wei)環境，有望(wang)進(jin)壹(yi)步提(ti)升重(zhong)組蛋白(bai)的表(biao)達效(xiao)率與活(huo)性(xing)。作為(wei)乳(ru)腺生(sheng)物反應器(qi)研(yan)究的標(biao)gan模型(xing)，它(ta)不(bu)僅為(wei)轉(zhuan)基(ji)因(yin)動物(wu)制備提(ti)供(gong)了高效(xiao)工具，也(ye)為(wei)動物(wu)基(ji)因(yin)編(bian)輯技(ji)術的臨(lin)床(chuang)轉化提(ti)供(gong)了重要參考(kao)。
以(yi)上信(xin)息僅供(gong)參考(kao)，詳(xiang)細信(xin)息請(qing)聯(lian)系我(wo)們(men)。
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