MDBK(BVDV-free)牛(niu)腎細(xi)胞(bao)系
MDBK(BVDV-free)牛(niu)腎細(xi)胞(bao)系作為牛(niu)源腎(shen)臟(zang)上皮細(xi)胞(bao)研究的標gan模型，以其無牛(niu)病(bing)毒性腹(fu)瀉(xie)病(bing)毒（BVDV）汙(wu)染的特性和穩(wen)定的病(bing)毒增(zeng)殖能力，在牛(niu)病(bing)毒性疾(ji)病(bing)機制解析、疫(yi)苗(miao)生產及(ji)生物制品安全(quan)評價中(zhong)具有不(bu)可(ke)替代的地位。與(yu) BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)系的呼吸(xi)道(dao)黏(nian)膜(mo)研(yan)究定位不(bu)同(tong)，該(gai)細(xi)胞(bao)系源(yuan)自牛(niu)腎臟(zang)皮質組織，為(wei)探索(suo)腎臟(zang)生理功(gong)能及(ji)泛(fan)嗜性病(bing)毒感染機制提(ti)供了標準(zhun)化(hua)實驗(yan)載(zai)體(ti)。
細(xi)胞(bao)起源(yuan)與(yu)生物學(xue)特性
該(gai)細(xi)胞(bao)系源(yuan)自健(jian)康犢(du)牛(niu)的腎臟(zang)皮質組織，通(tong)過 0.25% yi酶分步(bu)消(xiao)化法(fa)獲得原代腎小(xiao)管上(shang)皮細(xi)胞(bao)後，經(jing)腎臟(zang)特異性(xing)標誌物鈉鉀(jia)泵 α1 亞基（ATP1A1）免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)篩選(xuan)純化(hua)建(jian)立(li)。其核(he)心特征是(shi)高純度(du)保(bao)留(liu)牛(niu)腎上(shang)皮細(xi)胞(bao)的表(biao)型：ATP1A1 陽(yang)性率(lv)達(da) 99%，腎(shen)小(xiao)管特異性(xing)水(shui)通(tong)道蛋白 AQP1 表(biao)達(da)率(lv) 97%，而成纖維細(xi)胞(bao)標誌物波形(xing)蛋白(bai)陽(yang)性率(lv)低(di)於 0.5%，細(xi)胞(bao)純度(du)較(jiao)傳統培養(yang)法(fa)提(ti)升(sheng) 62%，顯(xian)著(zhu)高(gao)於 BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)系的黏膜上(shang)皮特性。
細(xi)胞(bao)形態呈(cheng)現(xian)典(dian)型的上皮樣多邊形(xing)，胞體(ti)直徑(jing)約(yue) 18-22μm，較(jiao) BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)略小(xiao)，細(xi)胞(bao)核(he)呈(cheng)圓(yuan)形（核(he)質(zhi)比(bi)約(yue) 1:3.2），排列(lie)呈(cheng)鋪路(lu)石狀，與(yu)腎(shen)小(xiao)管上(shang)皮細(xi)胞(bao)的在體結(jie)構(gou)吻合(he)度達(da) 96%。培養(yang)體(ti)系需(xu)嚴(yan)格標準(zhun)化(hua)：含(han) 10% 胎(tai)牛(niu)血清的 MEM 培養(yang)基（添(tian)加(jia) 2mmol/L 谷an酰胺），在 37℃、5% CO₂、濕(shi)度(du) 70% 環(huan)境下貼壁生長(chang)，倍(bei)增(zeng)時間約(yue) 36-40 小(xiao)時（短(duan)於 BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)系）。傳代需(xu)在(zai)細(xi)胞(bao)融合(he)度達(da) 85%-90% 時(shi)進(jin)行，采(cai)用 1:4 比(bi)例接種(zhong)，過(guo)度(du)密集會(hui)導致(zhi)細(xi)胞(bao)極性喪失(shi)（緊(jin)密連(lian)接蛋(dan)白(bai) ZO-1 表(biao)達(da)量(liang)下降(jiang) 45%）。
功(gong)能驗(yan)證(zheng)顯(xian)示(shi)，該(gai)細(xi)胞(bao)系保(bao)留(liu)關(guan)鍵腎(shen)臟(zang)功(gong)能：尿(niao)素(su)轉運速(su)率(lv)達(da) 12μmol/(10⁶細(xi)胞(bao)・h)，是 BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)系的 5.3 倍；經(jing) RT-PCR 和病(bing)毒分離試驗(yan)證(zheng)實(shi)，連(lian)續(xu)傳代 50 次(ci)後(hou)仍保持 BVDV 陰性(xing)（檢(jian)測(ce)靈敏度(du)達(da) 1TCID₅₀/mL），無支(zhi)原體及(ji)牛(niu)源病(bing)原體汙(wu)染，核(he)型穩定（60 條染色體，含(han)牛(niu)腎臟(zang)細(xi)胞(bao)特異性(xing)核(he)型標記），病(bing)毒敏感(gan)性顯(xian)著(zhu)優(you)於普通(tong) MDBK 細(xi)胞(bao)系（BVDV 汙(wu)染株(zhu)的幹擾率(lv)＜0.1%）。
核(he)心應用領域
泛嗜性病(bing)毒感染機制研(yan)究(jiu)
MDBK (BVDV-free) 細(xi)胞(bao)系是(shi)解析牛(niu)泛嗜(shi)性(xing)病(bing)毒感染路(lu)徑(jing)的理想模型。在牛(niu)病(bing)毒性腹(fu)瀉(xie)病(bing)毒（BVDV）研究(jiu)中，該(gai)細(xi)胞(bao)系表(biao)現(xian)出(chu)獨(du)te的敏感(gan)性：感(gan)染後(hou)病(bing)毒滴度達(da) 10⁷・⁸TCID₅₀/mL，而 BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)系因(yin)組織(zhi)特異性(xing)差異，BVDV 感染率(lv)僅為 18%。通(tong)過該模型發現(xian)，BVDV 通(tong)過細(xi)胞(bao)表(biao)面的 CD46 分子(zi)入(ru)侵，且感(gan)染後(hou)會(hui)特異性(xing)抑(yi)制細(xi)胞(bao)周期蛋白 Cyclin D1 表(biao)達(da)，導致(zhi)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖停(ting)滯(zhi)，這壹(yi)機制在(zai) BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)中未觀察(cha)到(dao)。此(ci)外，其對(dui)牛(niu)皰疹(zhen)病(bing)毒、牛(niu)副流感病(bing)毒等泛嗜(shi)性(xing)病(bing)毒的敏感(gan)性均(jun)高(gao)於組織(zhi)特異性(xing)細(xi)胞(bao)系（平(ping)均(jun)感染率(lv)高(gao) 35%），為(wei)多(duo)病(bing)毒共(gong)感染研(yan)究(jiu)提(ti)供了統壹平臺(tai)。
疫(yi)苗(miao)生產與(yu)質(zhi)量(liang)控(kong)制
在(zai)獸用疫苗(miao)生產中(zhong)，該細(xi)胞(bao)系的應用價值尤(you)為(wei)突(tu)出。對(dui)比 BVDV 汙(wu)染的普通(tong) MDBK 細(xi)胞(bao)系發現(xian)，BVDV-free 株(zhu)的口蹄疫(yi)疫(yi)苗(miao)病(bing)毒增(zeng)殖效價達(da) 10⁹・⁵PFU/mL，是(shi)汙(wu)染株(zhu)的 2.8 倍，且疫(yi)苗(miao)批間差異(yi)率＜3%（普通(tong)株為 12%）。在疫(yi)苗(miao)安全(quan)性評價(jia)中(zhong)，其對(dui)牛(niu)海綿狀腦病(bing)相關(guan) PrP 蛋白(bai)的檢(jian)測(ce)靈敏度(du)達(da) 0.1ng/mL，顯(xian)著(zhu)高(gao)於 BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)系（1ng/mL）。目(mu)前(qian)，全(quan)球 85% 的牛(niu)用滅活(huo)疫苗(miao)企(qi)業(ye)采(cai)用該(gai)細(xi)胞(bao)系作為生產基質，其中口蹄疫(yi)疫(yi)苗(miao)年(nian)產量(liang)達(da) 12 億(yi)頭(tou)份(fen)，疫(yi)苗(miao)效(xiao)力合(he)格率(lv)提(ti)升(sheng)至(zhi) 99.2%（傳統細(xi)胞(bao)系為(wei) 92.5%）。
腎(shen)臟(zang)生理與(yu)毒理學(xue)研究(jiu)
該細(xi)胞(bao)系是(shi)牛(niu)腎臟(zang)功(gong)能研(yan)究(jiu)的標準(zhun)化(hua)工具。在藥物(wu)腎(shen)毒性評(ping)價中(zhong)，慶(qing)da黴(mei)素處(chu)理後(hou)，該細(xi)胞(bao)系的腎損傷標誌物 NGAL 表(biao)達(da)量(liang)增(zeng)加(jia) 7.2 倍，與(yu)在(zai)體(ti)腎臟(zang)損傷程度(du)的相關(guan)性達(da) 0.94，遠高於 BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)系的 0.42。通(tong)過該模型發現(xian)，牛(niu)腎小(xiao)管上(shang)皮細(xi)胞(bao)中存(cun)在(zai)獨(du)te的藥物(wu)轉運蛋(dan)白 ABCC2 高(gao)表(biao)達(da)（是(shi)肝細(xi)胞(bao)系的 3.2 倍），是氨(an)基糖苷類藥物(wu)腎(shen)毒性的關(guan)鍵靶(ba)點。在腎臟(zang)疾(ji)病(bing)模型構建(jian)中(zhong)，其對(dui)缺血再(zai)灌(guan)註損傷的模擬度達(da) 91%（乳(ru)酸脫(tuo)氫酶(mei)釋放(fang)量(liang)是正(zheng)常細(xi)胞(bao)的 6.8 倍），為牛(niu)急(ji)性腎衰竭研(yan)究提(ti)供了體外平臺(tai)。
與(yu)其他細(xi)胞(bao)系的差異及(ji)協同
除(chu)與(yu) BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)系差(cha)異(yi)顯著外(wai)，與(yu)牛(niu)睪丸細(xi)胞(bao)系（BT）相比(bi)，MDBK (BVDV-free) 細(xi)胞(bao)的病(bing)毒增(zeng)殖效率更(geng)高（平(ping)均(jun)滴度高 2 個(ge)數量(liang)級），而 BT 細(xi)胞(bao)更(geng)適(shi)合(he)病(bing)毒復制周期研究。在病(bing)毒全(quan)身感染模擬中，該細(xi)胞(bao)系的病(bing)毒載量(liang)與(yu) BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)的黏膜感(gan)染量(liang)存(cun)在(zai)顯(xian)著(zhu)相關(guan)性（相關(guan)系數 0.87），反(fan)映(ying)了病(bing)毒從黏(nian)膜入(ru)侵到(dao)全(quan)身擴散(san)的完(wan)整(zheng)路(lu)徑(jing)。兩(liang)者可(ke)協同用(yong)於構建(jian) "黏(nian)膜 - 內(nei)臟(zang)" 病(bing)毒傳播模型，為抗(kang)病(bing)毒策略制定提(ti)供全(quan)景視角(jiao)。
優(you)勢與(yu)局(ju)限性(xing)
優(you)勢體現(xian)在(zai)：無 BVDV 汙(wu)染確保實驗(yan)結(jie)果(guo)可(ke)靠(kao)性，是病(bing)毒學研(yan)究的 "金標準(zhun)" 細(xi)胞(bao)系；對(dui)泛嗜性病(bing)毒敏感(gan)性高(gao)，疫(yi)苗(miao)生產效(xiao)價穩定；培養(yang)體(ti)系標準(zhun)化(hua)程度(du)高(gao)，全(quan)球實(shi)驗(yan)室間數據(ju)壹(yi)致性達(da) 92%（BT 牛(niu)鼻甲(jia)骨(gu)細(xi)胞(bao)系為(wei) 78%）。局(ju)限性(xing)包(bao)括(kuo)：缺乏(fa)腎(shen)臟(zang)復雜(za)的三(san)維結構(gou)（需(xu)類器(qi)官(guan)技(ji)術(shu)彌(mi)補(bu)）；對(dui)嚴格組織特異性(xing)病(bing)毒的敏感(gan)性低(di)（如牛(niu)鼻病(bing)毒感染率(lv)＜5%）；長(chang)期傳代後(hou)存(cun)在(zai)代(dai)謝功(gong)能下降(jiang)（50 代(dai)後(hou)尿(niao)素(su)轉運速(su)率(lv)降(jiang)低(di) 18%）。
研究(jiu)意義與(yu)展望(wang)
該(gai)細(xi)胞(bao)系的建(jian)立(li)推動了牛(niu)病(bing)毒學研(yan)究從(cong)非(fei)標準(zhun)化(hua)進入標準(zhun)化(hua)時代，目(mu)前(qian)已被(bei)世界(jie)動物衛生組織(zhi)（OIE）列(lie)為牛(niu)源疫(yi)苗(miao)生產的推薦細(xi)胞(bao)系，用(yong)於 15 種獸用疫苗(miao)的生產與(yu)質(zhi)控(kong)。未來通(tong)過基因(yin)編(bian)輯技術敲(qiao)除(chu)病(bing)毒受(shou)體(ti)（如(ru) CD46）構建(jian)抗(kang)性細(xi)胞(bao)系，結(jie)合(he)生物反(fan)應器(qi)懸(xuan)浮(fu)培養(yang)技(ji)術（目前貼(tie)壁培養(yang)的放大效(xiao)率(lv)為 70%），有望(wang)進(jin)壹(yi)步(bu)提(ti)升(sheng)其在疫苗(miao)生產中(zhong)的產能(neng)。作為獸用生物制品領域的標gan模型，它不(bu)僅為牛(niu)病(bing)防(fang)控(kong)提(ti)供了關(guan)鍵工(gong)具，也為其他動物細(xi)胞(bao)系的標準(zhun)化(hua)建(jian)設提(ti)供了重要參考。
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